avAbanico veterinarioAbanico vet2007-428X2448-6132Sergio Martínez González10.21929/abavet2021.4500129Artículos originalesDetección molecular de Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii en caninos domésticos del municipio de Cajeme, Sonora, MéxicoAragón-LópezCarlos1*Luna-NevárezPablo1Ortiz-EncinasVeronica1Leyva-CoronaJose1Cantú-SotoErnesto2Reyna-GranadosJavier1**Instituto Tecnológico de Sonora, Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinarias, Ciudad Obregón, Sonora. México.Instituto Tecnológico de SonoraInstituto Tecnológico de SonoraDepartamento de Ciencias Agronómicas y VeterinariasCiudad ObregónSonoraMexicoInstituto Tecnológico de Sonora, Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias, Ciudad Obregón, Sonora. México. Instituto Tecnológico de SonoraInstituto Tecnológico de SonoraDepartamento de Biotecnología y Ciencias AlimentariasCiudad ObregónSonoraMexico
Autor Responsable: Aragón-López Carlos.
Autor para correspondencia: Reyna-Granados Javier. Departamento de Ciencias Agronómicas y Veterinarias, Instituto Tecnológico de Sonora. Antonio Caso 2266, Villa Itson, C.P. 85130, Unidad Obregón, Campus Náinari. Ciudad Obregón, Sonora, México. E-mail: carlos.aragon@itson.edu.mx, pluna@itson.edu.mx, veronica.ortiz@itson.edu.mx, jose.leyva@itson.edu.mx, ernesto.cantu@itson.edu.mx, javier.reyna@itson.edu.mx28022022Jan-Dec202111e1292306202117122021Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsRESUMEN
Las zoonosis son un problema mundial con un impacto en la salud animal. Este grupo de enfermedades incluye Ehrlichiosis, Anaplasmosis y Rickettsiosis, en las cuales el vector es la garrapata Riphicephalus sanguineus, comúnmente conocida como garrapata marrón del perro. Recientes evidencias indican que este microorganismo actúa como vector de agentes zoonóticos bacterianos como Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii, que han infectado a un gran número de perros y humanos en el norte de México. Este estudio se realizó en el municipio de Cajeme, Sonora, utilizando muestras de sangre (n = 170) de canino. Se utilizaron técnicas moleculares para detectar 92 muestras positivas para Ehrlichia spp., 47 para Ehrlichia canis, 18 para Anaplasma platys y 2 para Rickettsia spp. Además, se encontró coinfección con Ehrlichia canis en 12 muestras positivas para Anaplasma platys. Se realizó la secuenciación de un positivo de cada patógeno, obteniendo 100% de homología en la plataforma "GenBank" (NCBI). Nuestros resultados enfatizaron la importancia del impacto zoonótico y la coinfección de estas enfermedades. Además, este es el primer estudio que confirma la identificación molecular de las especies Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii, así como su coinfección, en perros domésticos ubicados en el municipio de Cajeme, Sonora.
Palabras clave:zoonosisvectores de Ehrlichiosiscoinfeccióntécnicas molecularesINTRODUCCIÓN
Las zoonosis involucran varias enfermedades que representan un problema mundial significativo que afecta a la salud humana y animal (García et al., 2013). Dichas enfermedades incluyen Ehrlichiosis, Anaplasmosis y Rickettsiosis que son causadas por una bacteria gramnegativa la cual se caracteriza por un crecimiento intracelular obligado (género Rickettsia, familia Rickettsiaceae; género Ehrlichia y Anaplasma, familia Anaplasmataceae). Estos se transmiten principalmente por ectoparásitos, incluida la garrapata Riphicephalus sanguineus, o garrapata marrón del perro, que afecta a los vertebrados terrestre (Parola et al., 2009; Alvarez, 2017). Varios estudios han demostrado que estos ectoparásitos actúan como vectores de agentes zoonóticos como Erlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii (Gaunt et al., 2010).
E. canis causa una enfermedad zoonótica en perros, gatos y roedores; el humano es una víctima accidental después de ser picado por la garrapata Rhipicephalus alojada en estos animales. Después de la infección, el microorganismo se incuba durante 1-2 semanas y entra en los vasos sanguíneos y linfáticos; luego, viaja al bazo, hígado y ganglios linfáticos para multiplicarse por fusión binaria y extenderse a otros órganos del cuerpo (Castro et al., 2004).
E. canis se considera una bacteria de distribución cosmopolita. En México, fue descrita por primera vez en 1996 y clasificada como endémica porque se ha reportado en todo el país, pero principalmente en estados del noroeste como Sonora y Sinaloa. En Sonora, E. canis se considera una emergencia sanitaria y un problema de salud pública cada vez mayor. Desde 2002 se han reportado más de 600 casos, la gran mayoría en municipios del norte del estado (Álvarez, 2017; Sosa et al., 2013).
Los signos clínicos de la fase aguda de la enfermedad son alteraciones hematológicas, leucopenia, trombocitopenia y anemia leve a moderada; la fase crónica se caracteriza por trombocitopenia, epistaxis, nefropatía, disnea, hepatomegalia, esplenomegalia o linfadenopatía, meningitis inflamatoria o hemorrágica, entre otras (Ismail et al., 2010).
A. platys se distribuye en todo el mundo y también es transmitida por las garrapatas R. sanguineus. Se describió por primera vez en 1978 en perros de Estados Unidos (Sánchez & Tesouro, 2001). Esta bacteria pertenece al género Anaplasma (Ábrego et al., 2009). Causa trombocitopenia cíclica infecciosa canina. La enfermedad puede presentarse con fiebre, anorexia, petequias, uveítis, linfadenopatía generalizada, leucopenia, anemia moderada y especialmente trombocitopenia, que ocurren en episodios de 3-4 días a intervalos de 7-21 días, lo que eventualmente conduce a trombocitopenia crónica con recuperación lenta (Cicuttin et al. 2014).
Actualmente se ha detectado A. platys con baja incidencia en los estados de Coahuila, Durango y Sonora (Almazán et al., 2016; Murrieta et al., 2017). Como enfermedad zoonótica, Arraga et al. (2014) reportaron dos mujeres en Venezuela que estuvieron expuestas a R. sanguineus. Posteriormente se observaron cuerpos de inclusión intraplaquetarios sugestivos de A. platys en frotis y se amplificó y secuenció el ADN de
A. platys a partir de sangre completa, aunque el tratamiento con doxiciclina no alivió sus síntomas. Estos casos brindan apoyo adicional para A. platys como patógeno zoonótico transmitido por garrapatas, muy probablemente de baja patogenicidad; sin embargo, no se ha confirmado la causa de la enfermedad de A. platys en humanos. R. rickettsii es el principal agente de fiebre maculosa en las Américas; Se han reportado casos en los EE. UU., Canadá, México, Costa Rica, Panamá, Colombia, Brasil y Argentina (López et al., 2007; Herrero et al., 2010; Lebruna et al., 2011), con una alta tasa de mortalidad debido a la detección tardía del patógeno (Oteo et al., 2014). Se considera que México cuenta con las condiciones ideales para el ciclo de transmisión de la enfermedad, comúnmente asociada a las condiciones de vida (pobreza) ya que la mayoría de los casos presentados han sido detectados en zonas marginadas y rurales de México (Peniche et al., 2015). Estudios recientes demostraron la presencia de Rickettsia spp. en garrapatas del estado de Sonora por técnica de PCR (Foley et al., 2019).
Estos patógenos podrían estar presentes previamente en la garrapata, provocando coinfecciones simultáneas en el huésped (es decir, se puede transmitir más de un agente), lo que provocará la enfermedad al mismo tiempo. Esto puede resultar en la manifestación de signos clínicos, de forma más severa e inespecífica, siendo una desventaja para el diagnóstico clínico por parte de los médicos humanos y veterinarios que atienden estos casos (Alleman & Wamsley, 2008; Mutz et al., 2009).
Considerando la importancia zoonótica de estas enfermedades, y que no se han reportado estudios previos en el municipio de Cajeme, Sonora, la presencia de vectores de E. canis, A. platys y R. rickettsii en perros domésticos del municipio son sugestivos a la presencia de estas enfermedades zoonóticas. Por tanto, el objetivo fue la identificación molecular de las especies E. canis, A. platys y R. rickettsii para determinar su coinfección en perros domésticos del municipio de Cajeme, Sonora.
MATERIAL Y MÉTODOSTipo de estudio
Se Desarrollo un estudio de tipo observacional descriptive para detectar la presencia de
Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii.
Área de estudio
El presente trabajo se realizó a partir de muestras de sangre de perros enviadas al Laboratorio de Biología Molecular de Medicina Veterinaria y Zootecnia del Instituto Tecnológico de Sonora, provenientes de clínicas veterinarias privadas del municipio de Cajeme en el estado de Sonora, México.
Muestreo experimental
Utilizamos 170 muestras de sangre entera canina con anticoagulante EDTA de un laboratorio de diagnóstico veterinario comercial ubicado en Ciudad Obregón, Sonora. Solo se seleccionaron caninos con diagnóstico clínico presuntivo o positivo para E. canis, A. platys y R. rickettsii con base en la sintomatología presentada y análisis complementarios realizados, como frotis de sangre y hemogramas. Las muestras fueron transportadas al Laboratorio de Biología Molecular Veterinaria del ITSON y en todos los casos se mantuvieron a 4°C hasta su procesamiento final, por un período no mayor a 24 horas.
Procesamiento de muestras de sangre
Las muestras fueron descongeladas y centrifugadas durante 15 minutos a 3,500 rpm para obtener 200 µl de capa de leucoplaquetaria e iniciar la extracción del material genético.
Extracción de ADN bacteriano
Para la extracción del ADN de las muestras de sangre, se utilizó el kit comercial DNeasy Blood and Tissue (QIAGEN®) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad, calidad y pureza del ADN se midió en un espectrofotómetro automático BioSpect-nano (Shimadzu), y la integridad se observó en gel de agarosa al 1.5% teñido con 1.5 µl de bromuro de etidio.
Síntesis de controles positivos
Se utilizó la herramienta BLASTn GenBank® de la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information) para descargar las secuencias obtenidas de los alineamientos. Dichos alineamientos se realizaron utilizando los cebadores específicos de las bacterias Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii, en formato FASTA. Se diseñaron los primeros 50 pb (forward) y después 50 pb (reverse) permitiendo así la alineación de los oligonucleótidos. Las secuencias fueron ingresadas a la plataforma IDT (Integrated DNA Technologies) para la síntesis de los fragmentos del gen gBlocks™, facilitando la estandarización para la detección por PCR de cada uno de los microorganismos en estudio.
Amplificación por PCR
Las muestras de ADN se analizaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los conjuntos de cebadores descritos en la Tabla 1. Inicialmente, los ensayos de PCR se dirigieron a los géneros Eherlichia spp., Anaplasma spp. y Rickettsia spp. Las muestras que dieron positivo para cada género se sometieron a una segunda PCR con cebadores específicos para E. canis, A. platys y R. rickettsii.
Cebadores utilizados para detección del agente en muestras de sangre canina
Para las reacciones se utilizó el kit precargado GoTaq® Flexi DNA Polymerase PCR (Promega) que contiene Green GoTaq®, que sirve como tampón de reacción y solución de carga de gel, lo que permite cargar las reacciones directamente para un análisis rápido y eficiente. Las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 μl, comenzando con las concentraciones del fabricante: 1X Green GoTaq Buffer 5x, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM para cada dNTP, 0.4 μM de cada cebador, 1.25 u de GoTaq DNA Polymerase, 2 μl de DNA y H2O libre de nucleasas a 25 µL. El producto se identificó en gel de agarosa al 1.5% y bromuro de etidio, considerando bandas positivas con el tamaño de cada agente.
Secuenciación y análisis en silico de fragmenmtos amplificados
Un producto de PCR de cada microorganismo que resultó positivo, también se purificó con el kit comercial Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) para corroborar que el fragmento amplificado pertenece a las regiones de interés. Luego, los amplicones fueron secuenciados utilizando el proceso de Sanger realizado en la unidad Langebio Cimvestav Lab Irapuato. Los fragmentos generados con secuencias de nucleótidos representativas de cada bacteria fueron analizados con el programa Snapgene Viewer, y sometidos al algoritmo BLASTn para evaluar el porcentaje de homología de cada agente con las secuencias disponibles en la base de datos GenBank.
RESULTADOS
Se observó por medio de electroforesis, una buena integridad de las moléculas de ADN bacteriano extraído, con una cuantificación por espectrofotometría de 248.32 ng/µl en las muestras y una pureza con la relación 260-280 en promedio de 1.85, partiendo de sangre entera con EDTA.
Para la técnica de PCR se utilizó una concentración de 0.5 ng/µl de cada gblocks como controles positivos, obteniendo los pb correspondientes de cada agente, logrando una buena eficiencia y rapidez para la estandarización molecular con las condiciones específicas de cada agente patógeno.
El número de casos positivos y la frecuencia de Ehrlichis spp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia spp. obtenidos del análisis molecular de muestras de sangre canina (n=170) se describen en la Tabla 2. De las 92 muestras que dieron positivo para Ehrlichia spp. Se encontraron 12 coinfecciones (Tabla 3) de Ehrlichia canis con Anaplasma platys (Género EA) (13%).
Número de casos e incidencia de <italic>Ehrlichia canis Anaplasma platys</italic> y <italic>Rickettsia rickettsi</italic> en perros de Cajeme, Sonora, mediante PCR (n=170)
Agente
PCR
Positivos
Frecuencia
Ehrlichia spp
92
54%
Ehrlichia canis
47
28%
Anaplasma platys
18
11%
Rickettsia spp.
2
0.8%
Co-infecciones y frecuencia en perros positivos al género EA
Co-infecciones
PCR
(E. canis / A. platys)
Positivos 92
Positivos
12
Frecuencia
13%
Además, se realizó la secuenciación de una muestra de cada positivo para las diferentes especies de microorganismos analizados, obteniendo cromatogramas puros los cuales fueron analizados con el programa SanpGene Viewer. El análisis de las secuencias en el programa BLASTn (Centro Nacional de Información Biotecnológica) detectó una similitud entre el 99 y el 100% con las secuencias reportadas previamente.
DISCUSIÓN
Los microorganismos del orden Rickettsiales presentan condiciones zoonóticas denominadas Rickettsiosis, Ehrlichiosis y Anaplasmosis que se deben a varios patógenos de importancia veterinaria que han ganado terreno no solo en nuestra región sino también a nivel mundial (Rodríguez et al. 2016), esto se debe principalmente a su vector Rhipicephalus sanguineus, siendo la especie de garrapata más reportada y con mayor distribución geográfica (Sosa et al., 2016; Cabezas-Cruz et al., 2019). Estos patógenos van en aumento debido a la actividad del ser humano que ha generado cambios radicales en el medio ambiente, favoreciendo las enfermedades transmitidas por vectores (Suthers, 2004) y aumentando su prevalencia a finales de primavera y verano debido a que estos ectoparásitos aumentan su actividad en las altas temperaturas ambientales durante estas estaciones del año, inoculando más rápidamente los hemoparásitos mencionados (Parola et al., 2009), siendo necesaria la estandarización de técnicas precisas para la detección de estos microorganismos zoonóticos del orden Rickettsiales en las regiones Tropicales y Subtropicales.
Actualmente, el uso de fragmentos del gen gBlocks como controles positivos utilizados en este estudio se ha vuelto popular como estándares y positivos sintéticos para la detección de microorganismos bacterianos. Actualmente se reportaron datos similares en Barcelona donde se utilizaron este tipo de fragmentos para la detección de E. coli, E. faecalis y Legionella pneumiphilia (Cardenas, 2018); además, en Australia dichos fragmentos se utilizaron como estándares en la detección por PCR multiplex de Taenia spp. (Ng-Nguyen et al., 2017) Por lo tanto, se recomienda el uso de gBlocks para la estandarización de PCR ya que aumentó la velocidad del bioensayo en la detección debido a la falta de disponibilidad de aislados biológicos.
El estudio fue el primer trabajo mediante PCR para detectar las especies Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsi en muestras de sangre de perros en el municipio de Cajeme y en Sonora, permitiendo conocer la distribución geográfica ampliada de los tres patógenos en el estado. El porcentaje de 54% a al menos un agente patógeno en nuestro estudio concuerda con investigaciones realizadas con herramientas moleculares en algunos países de América del Sur y Central, donde Brasil reportó 69% (Tanikawa et al., 2013), Nicaragua 80% (Wei et al., 2014), Panamá 70,6% (Santamaria et al., 2014), Costa Rica 45% (Rojas et al., 2015) y El Salvador 60% (Miranda et al., 2018). Nuestro porcentaje de prevalencia difirió al compararlo con porcentajes altos de otros países, probablemente por trabajar con perros sin dueño y por estar más en contacto con el vector de las enfermedades al estar asociado a condiciones de vida en zonas marginadas (Peniche et al., 2015). Se ha reportado prevalencia a hemoparásitos en algunos otros estados de México, donde Sinaloa reporta 74.3% (Sosa-Gutiérrez et al., 2013), Coahuila y Durango 41% (Almazán et al., 2016), Yucatán 69% (Díaz et al., 2016), Chihuahua 40% (Escárcega et al., 2018) y Sonora 33% (Murrieta et al., 2017). Como se mencionó anteriormente, Cajeme presentó el 57% de la infección, posicionando a Sonora en este momento como uno de los principales estados con mayor incidencia en las regiones tropicales y subtropicales donde están presentes los parásitos y el vector.
Con respecto al porcentaje de presencia de cada hemoparásito, evidencio nuestro estudio una prevalencia mayor de E. Canis a lo reportado en México (28%), ya que en otro estudio de Sonora en el municipio de San Luis Rio Colorado, se encontró del 8% de infección para E. Canis en muestras sanguíneas de 235 perros (Murrieta et al., 2017), en el Estado de Coahuila y Durango 10% en una población de 100 perros sanos infestados con garrapatas (Almazán et al., 2016). En Yucatán se determinó el 36% en una población de 50 perros (10 perros domésticos y 40 en un centro de control de animales), en donde todos los perros positivos fueron de muestras recolectadas del refugio de animales, lo que representa una prevalencia, para este sitio de muestreo del 45% (Path et al., 2015). También existes hallazgo en otros países como Buenos Aires, Argentina, en donde los resultados fueron de igual manera inferiores en una población de 223 perros, obteniendo el 6.7% de positivos a E. Canis (Cicuttin, 2016), Uruguay es uno de los pocos países en los cuales reporta presencia de otros hemoparásitos, pero no la presencia de E. Canis en una población de 191 perros (Carvalho, 2017). En contraste con Brasil, el porcentaje de nuestro estudio es menor, en donde trabajaron con 472 perros en el noreste brasilero encontraron el 34.5% de los perros positivos (Silva et al., 2010), siendo superior a nuestros resultados. Colombia representa la mayor zona de alta prevalencia revisada sobre E. canis en sus municipios de Palmira (92.8%) y Cartago (90%) (Rojas et al., 2013). No obstante, cabe mencionar que dicho trabajo se realizó en perros callejeros a diferencia de nuestro estudio.
La presencia de Anaplasma platys (11%) en nuestro estudio, resultó ser superiores a los reportados en Buenos Aires, Argentina de 223 perros, siendo positivos para A. platys el 7.2% (Cicuttin, 2016). En Uruguay de 191 perros resultaron positivos el 4.2% (Carvalho, 2017). También en San Luis Rio Colorado, Sonora en 235 muestras caninas fueron positivas para el 18% (Murrieta et al., 2017). Otras publicaciones muestran valores similares a Costa Rica con el 10% (Wei et al., 2014), Nicaragua el 13% (Rojas et al., 2014), Cuba el 16% (Silva et al., 2016) y el Salvador con 17% (Murrieta, 2017), pero resultaron ser inferior con respecto a Panamá con el 21.3%. En Brasil, en una población de 100 perros, se obtuvo mayor prevalencia para Anaplasma platys con el 21% y 9% para Ehrlichia, siendo uno de los pocos estudios que difiere en nuestros resultados, ya que, en nuestro trabajo y la mayoría de las investigaciones realizadas en centro y Sudamérica, reportan una menor incidencia de A. Platys que de E. canis.
El diagnóstico molecular en nuestra investigación de hemoparásitos relacionados a Ehrlichia y Anaplasma han sido sencillo de identificar a diferencia de la bacteria Rickettsia rickettsii con la técnica de PCR a partir de muestras sanguíneas en caninos. Nuestro porcentaje de prevalencia a este agente fuel el menor (0.8%) a comparación de E. canis y A. platys, esto puede deberse a que típicamente se menciona que circula un bajo número de rickettsias en la sangre en ausencia de enfermedad avanzada o infección fulminante (CDC, 2017; Tinoco et al., 2018).
Debido a esto encontramos en la literatura diferentes investigaciones, en su mayoría dirigidas al diagnóstico de Rickettsia spp. y R. rickettsii en garrapatas R. sanguineus en perros de diferentes regiones, como es el caso de Yucatán, seleccionando 28 perros donde se colectaron 106 garrapatas Rhipicephalus sanguineus con una incidencia del 26% (Peniche et al., 2015) En Matamoros, Coahuila, se realizó la técnica de PCR de punto final para el análisis de 100 garrapatas (Rhipicephalus sanguineus) dando como positivo a Rickettsia spp el 4% de las muestras analizadas (Castillo et al., 2015). En Mexicali Baja California, México, se analizaron mediante PCR garrapatas de perro pertenecientes a la morfología de Rhipicephalus sanguineus, resultando muestras positivas con 100% de homología a R. rickettsii (Foley et al., 2019). Actualmente Sonora lidera las entidades con más reportes de Rickettsiosis en el país, siendo Cajeme una de las principales ciudades con más casos de muerte, a pesar de ser un dato asociado a la salud pública, es importante conocer la incidencia de R. rickettsii en animales ((PSS, 2014), dándole mayor importancia a nuestro trabajo, pues no solo se detectó Rickettsia spp. Debido a que esas muestras salieron positivas a R. rickettsii, con 100% de homología al género con el gen gltA y la especie con el gen OmpA en muestras de sangre de 2 perros (n = 170), estos genes son los más utilizados para la detección de la bacteria que causan la fiebre maculosa.
Los resultados obtenidos de los tres agentes, aumenta la alerta y la incidencia de casos asociados a las Rickettsiales en el estado de Sonora transmitida por la garrapata café Riphicephalus sanguineus, que actualmente es el vector más importante de Rickettsiales en México (Labruna, 2009), constituyendo un problema de salud pública, pues se le consideran a R. rickettsii, E. canis y A. platys enfermedad zoonótica por la CDC en el 2017 y que al pasar de los años han adquirido mayor territorio de infección. Como se mencionó anteriormente, estos patógenos pueden estar presentes en la garrapata, provocando co-infecciones simultáneas en el hospedero, es decir más de un solo agente puede ser transmitido, como se demuestra en la presente investigación, encontrando el 13% de co-infección a los agentes E. canis y A. platys.
La presencia de co-infección con estas bacterias en nuestro estudio no es un hallazgo extraño, ya que son los más comunes en Latinoamérica, basándonos en algunos porcentajes similares obtenidos en Panamá, que reportan una co-infecciones entre E. canis y A. platys del 7.5% (Santamaría et al., 2014), El Salvador con 4.5% (Miranda et al., 2018) y San Luis Rio Colorado, Sonora con el 12.2% (Murrieta et al., 2017), mencionando que este último es muy semejante a nuestros resultados de co-infeccion y es del mismo estado.
Es fundamental considerar que el 46% restante de las muestras negativas en el estudio a género y especie, debido a la ausencia de los patógenos o a la presencia de otras enfermedades, ya que en la investigación todas las muestras de sangre provenían de presuntos perros o que manifestaban síntomas clínicos, aunque también puede deberse a la presencia en cantidades bajas e indetectables de los agentes patológicos.
Finalmente, es importante resaltar que las diferencias encontradas entre las muestras positivas a género y negativas a E. canis, A. platys y R. rickettsi probablemente se deban a que los cebadores utilizados en la primera PCR de género (ECC/ ECB) también amplifican otras especies, lo que podría indicar infección por otras especies de Ehrlichia (E. ewingii u otras) u otras especies de la familia Anaplasmataceae (A. phagocytophilum u otras).
CONCLUSIONES
El porcentaje de hemoparásitos en perros domésticos reportado en este estudio, posiciona actualmente a Sonora como uno de los principales estados con mayor frecuencia en regiones tropicales y subtropicales. Los tres agentes fueron detectados por técnicas moleculares en sangre de perros sospechosos de la ciudad de Cajeme, Sonora, identificándose Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii con frecuencias de 28%, 11% y 0.8%, respectivamente. Además, estos tres agentes fueron confirmados por secuenciación. En cuanto a las co-infecciones, solo se detectaron simultáneamente Ehrlichia canis y Anaplasma platys con un 13% de frecuencia. Esta es la primera investigación de identificación molecular en nuestro estado, confirmando la presencia de Ehrlichia canis, Anaplasma platys y Rickettsia rickettsii a partir de sangre total de caninos.
LITERATURA CITADAÁbrego L, Dolz G, Romero J, Bernardo V, Meneses A. 2009. Detección molecular de Anaplasma platys en perros de Costa Rica. Ciencias Veterinarias. 27(2):71-80. ISSN: 0250-5649. http://www.revistas.una.ac.cr/index.php/veterinaria/article/view/4984/4778ÁbregoLDolzGRomeroJBernardoVMenesesA.2009Detección molecular de Anaplasma platys en perros de Costa RicaCiencias Veterinarias27271800250-5649http://www.revistas.una.ac.cr/index.php/veterinaria/article/view/4984/4778Alleman R, Wamsley HL. 2008. An update on anaplasmosis in dogs. Veterinary Medicine. 103. https://www.researchgate.net/publication/288555993_An_update_on_anaplasmosis_in_ dogsAllemanRWamsleyHL.2008An update on anaplasmosis in dogsVeterinary Medicine103https://www.researchgate.net/publication/288555993_An_update_on_anaplasmosis_in_ dogsAlmazán C, González VH, Fernández IG, Cabezas A, Rodríguez R, de la Fuente J. 2016. Molecular identification and characterization of Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs in Mexico. Ticks and Tick-borne Diseases. 7(2):276-283. ISSN: 1877-959X. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2015.11.002AlmazánCGonzálezVHFernándezIGCabezasARodríguezRde la FuenteJ.2016Molecular identification and characterization of Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs in MexicoTicks and Tick-borne Diseases722762831877-959X10.1016/j.ttbdis.2015.11.002Álvarez R. 2017. Revisión sobre la biología de Rhiphicephalus sanguineus (ARTHROPODA, CHELICERATA) (LATREILLE, 1806). Sustainability, Agri, Food and Environmental Research. 5(1):11-16. https://doi.org/10.7770/safer-V5N1-art1173ÁlvarezR.2017Revisión sobre la biología de Rhiphicephalus sanguineus (ARTHROPODA, CHELICERATA) (LATREILLE, 1806)Sustainability, Agri, Food and Environmental Research51111610.7770/safer-V5N1-art1173Arraga CM, Parra OC, Hegarty BC, Breitschwerdt EB, Qurollo BA, Berrueta MA. 2014. Molecular Evidence of Anaplasma platys Infection in Two Women from Venezuela. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91(6):1161-1165. ISSN: 0002-9637. https://doi.org/10.4269/ajtmh.14-0372ArragaCMParraOCHegartyBCBreitschwerdtEBQurolloBABerruetaMA.2014Molecular Evidence of Anaplasma platys Infection in Two Women from VenezuelaThe American Journal of Tropical Medicine and Hygiene916116111650002-963710.4269/ajtmh.14-0372Cabezas-Cruz A, Allain E, Ahmad AS, Saeed MA, Rashid I, Ashraf K, Estrada-Peña A. 2019. Low genetic diversity of Ehrlichia canis associated with high co-infection rates in Rhipicephalus sanguineus (sl). Parasites & Vectors. 12:12. https://doi.org/10.1186/s13071-018-3194-9Cabezas-CruzAAllainEAhmadASSaeedMARashidIAshrafKEstrada-PeñaA.2019Low genetic diversity of Ehrlichia canis associated with high co-infection rates in Rhipicephalus sanguineus (sl)Parasites & Vectors12121210.1186/s13071-018-3194-9Cardenas YI. 2018. Determinación de la contaminación microbiológica del agua de riego aplicando nuevas estrategias de análisis. Tesis dedoctorado, Universidad de Barcelona. España. http://www.file:///C:/Users/74998/Downloads/YICY_TESIS.pdfCardenasYI.2018Determinación de la contaminación microbiológica del agua de riego aplicando nuevas estrategias de análisisTesis dedoctoradoUniversidad de BarcelonaEspañahttp://www.file:///C:/Users/74998/Downloads/YICY_TESIS.pdfCarvalho L, Armua MT, Sosa N, Félix ML, Venzal JM. 2017. Anaplasma platys in dogs from Uruguay. Ticks Tick Borne Dis. 8(2):241-245. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2016.11.005CarvalhoLArmuaMTSosaNFélixMLVenzalJM.2017Anaplasma platys in dogs from UruguayTicks Tick Borne Dis8224124510.1016/j.ttbdis.2016.11.005Castillo M, Cueto SM, Hernández Sergio, Gallegos MA, Valdéz M, Sánchez FJ, Ortega AI. 2015. Detección de Rickettsia sp. en la garrapata café del perro Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) en Matamoros, Coahuila, México. Acta Zoológica Mexicana. 31(1):80-83. http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0065-17372015000100011&lng=es&tlng=esCastilloMCuetoSMSergioHernándezGallegosMAValdézMSánchezFJOrtegaAI.2015Detección de Rickettsia sp. en la garrapata café del perro Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) en Matamoros, Coahuila, MéxicoActa Zoológica Mexicana3118083http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0065-17372015000100011&lng=es&tlng=esCastro MB, Machado RZ, Aquino LP, Alessi AC and. Costa MT. 2004. Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunopathological findings. Veterinary Parasitology. 1(119):73-86. ISSN:0304-4017. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2003.10.012CastroMBMachadoRZAquinoLPAlessiACCostaMT.2004Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunopathological findingsVeterinary Parasitology1119738610.1016/j.vetpar.2003.10.012CDC (Center for Disease Control and Prevention). 2017. Rickettsial (spotted & typhus fevers) & related infections, including Anaplasmosis & Ehrlichiosis. https://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2018/infectious-diseases-related-to-travel/Rickettsial-spotted-and-typhus-fevers-and-related-infections-including-anaplasmosis-and-ehrlichiosis#5251.CDC (Center for Disease Control and Prevention)2017Rickettsial (spotted & typhus fevers) & related infections, including Anaplasmosis & Ehrlichiosishttps://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2018/infectious-diseases-related-to-travel/Rickettsial-spotted-and-typhus-fevers-and-related-infections-including-anaplasmosis-and-ehrlichiosis#5251Cicuttin G, Vidal P. De Salvo M, Beltrán F, Gury F. 2014. Detección molecular de Rickettsia massiliae y Anaplasma platys en garrapatas Rhipicephalus sanguineus y caninos domésticos del municipio de Bahía Blanca (Argentina). Revista chilena de infectología. 31(5):563-568. ISSN: 0716-1018. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182014000500008CicuttinGVidalP.De SalvoMBeltránFGuryF.2014Detección molecular de Rickettsia massiliae y Anaplasma platys en garrapatas Rhipicephalus sanguineus y caninos domésticos del municipio de Bahía Blanca (Argentina)Revista chilena de infectología3155635680716-101810.4067/S0716-10182014000500008Cicuttin G, De Salvo M.N , Gury FE. 2016. Molecular characterization of Ehrlichia canis infecting dogs, Buenos Aires. Ticks Tick Borne Dis. 7(5):954-957. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2016.04.017CicuttinGDe SalvoM.NGuryFE.2016Molecular characterization of Ehrlichia canis infecting dogs, Buenos AiresTicks Tick Borne Dis7595495710.1016/j.ttbdis.2016.04.017Díaz OC, Bolio ME, Rodríguez RI, Gutiérrez EJ, Pérez C. 2016. Estudio molecular de Ehrlichia canis en perros de México: prevalencia de infección y posibles factores asociados. Ecosistemas y recursos agropecuarios. 3(8):251-257. http://www.scielo.org.mx/pdf/era/v3n8/2007-901X-era-3-08-00251.pdfDíazOCBolioMERodríguezRIGutiérrezEJPérezC.2016Estudio molecular de Ehrlichia canis en perros de México: prevalencia de infección y posibles factores asociadosEcosistemas y recursos agropecuarios38251257http://www.scielo.org.mx/pdf/era/v3n8/2007-901X-era-3-08-00251.pdfEscárcega AM, Luna BS, Mora A DL, Jiménez F. 2018. Análisis exploratorio de enfermedades Rickettsiales transmitidas por garrapatas en perros de Ciudad Juárez, Chihuahua, México. Acta Universitaria. 28(3):72-78. https://doi.org/10.15174/au.2018.1678EscárcegaAMLunaBSMora ADLJiménezF.2018Análisis exploratorio de enfermedades Rickettsiales transmitidas por garrapatas en perros de Ciudad Juárez, Chihuahua, MéxicoActa Universitaria283727810.15174/au.2018.1678Foley J, Tinoco L, Rodriguez M, Estrada J, Fierro M, Mattar E, Peterson A, Pascoe E, Gonzalez Y, Hori S, Armstrong PA, Lopez G, Jacome M, Paddock CD, Zazueta OE. 2019. Unbiased assessment of abundance of Rhipicephalus sanguineus sensu lato ticks, canine exposure to spotted fever group rickettsia, and risk factors in Mexicali, Mexico. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 101(1):22-32. ISSN: 0002-9637. https://doi.org/10.4269/ajtmh.18-0878FoleyJTinocoLRodriguezMEstradaJFierroMMattarEPetersonAPascoeEGonzalezYHoriSArmstrongPALopezGJacomeMPaddockCDZazuetaOE.2019Unbiased assessment of abundance of Rhipicephalus sanguineus sensu lato ticks, canine exposure to spotted fever group rickettsia, and risk factors in Mexicali, MexicoThe American Journal of Tropical Medicine and Hygiene101122320002-963710.4269/ajtmh.18-0878Gaunt S, Beall MJ, Stillman BA, Lorentzen L, Diniz PPVP, Chandrashekar R, Breitschwerdt EB. 2010. Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platy and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findings. Parasites & Vectors. 3(33). ISSN: 1756-3305. https://doi.org/10.1186/1756-3305-3-33GauntSBeallMJStillmanBALorentzenLDinizPPVPChandrashekarRBreitschwerdtEB.2010Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platy and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findingsParasites & Vectors3331756-330510.1186/1756-3305-3-33Gutiérrez CN, Pérez L, Agrela IF. 2016. Ehrlichiosis canina, Universidad de Carabobo. Saber. 28(4):641-665. http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S131501622016000400002&lng=e s&tlng=enGutiérrezCNPérezLAgrelaIF.2016Ehrlichiosis canina, Universidad de CaraboboSaber284641665http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S131501622016000400002&lng=e s&tlng=enHerrero JA, García E, Hernández Gómez, J. 2010. Infecciones por rickettsias y fiebre Q. Medicine Programa de Formación Médica Continuada Acreditado. 10(57):3881-3888. https://doi.org/10.1016/S0304-5412(10)70131-1HerreroJAGarcíaEHernández GómezJ.2010Infecciones por rickettsias y fiebre QMedicine Programa de Formación Médica Continuada Acreditado10573881388810.1016/S0304-5412(10)70131-1Ismail N, Bloch KC, McBride JW. 2010. Human ehrlichiosis and anaplasmosis. Clinics in Laboratory Medicine. 30(1):261-292. ISSN: 0272-2712. https://doi.org/10.1016/j.cll.2009.10.004IsmailNBlochKCMcBrideJW.2010Human ehrlichiosis and anaplasmosisClinics in Laboratory Medicine3012612920272-271210.1016/j.cll.2009.10.004Krüttgen A, Razavi, S, Imöhl, M. 2011. Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi Metallo-β-lactamase-1 (bla NDM-1). Medical Microbiology and Immunology. 200(1):137- 141. ISSN: 1432-1831. https://doi.org/10.1007/s00430-011-0189-yKrüttgenARazaviSImöhlM.2011Real-time PCR assay and a synthetic positive control for the rapid and sensitive detection of the emerging resistance gene New Delhi Metallo-β-lactamase-1 (bla NDM-1)Medical Microbiology and Immunology2001137 1411432-183110.1007/s00430-011-0189-yLabruna MB. 2009. Ecology of rickettsia in South America. Ann NY Acad Sci. 1166(1): 156-166. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2009.04516.xLabrunaMB.2009Ecology of rickettsia in South AmericaAnn NY Acad Sci1166115616610.1111/j.1749-6632.2009.04516.xLebruna MB, Mattar VS, Nava S, Bermudez M, Venzal JM, Dolz G, Abarca K, Romero L, Sousa R, Oteo J and Zavala CJ. 2011. Rickettsioses in Latin America, Caribbean, Spain and Portugal. Revista MVZ Córdoba. 16(2):2435-2457. ISNN-L: 0122-0268. https://doi.org/10.21897/rmvz.282LebrunaMBMattarVSNavaSBermudezMVenzalJMDolzGAbarcaKRomeroLSousaROteoJZavalaCJ.2011Rickettsioses in Latin America, Caribbean, Spain and PortugalRevista MVZ Córdoba162243524570122-026810.21897/rmvz.282López PJ, Abarca VK, Azócar AT. 2007. Evidencia clínica y serológica de Rickettsiosis canina en Chile. Revista chilena de infectología. 24(3):189-193. ISSN: 0716-1018. https://doi.org/10.4067/s0716-10182007000300002LópezPJAbarcaVKAzócarAT.2007Evidencia clínica y serológica de Rickettsiosis canina en ChileRevista chilena de infectología2431891930716-101810.4067/s0716-10182007000300002Miranda RE, Najarro RA, Navarrete IV. 2018. Detección molecular de Anaplasma platys, Babesia spp., Ehrlichia canis y Hepatozoon canis en caninos (Canis lupus familiaris) con sospecha de hemoparásitos en clínicas veterinarias de Santa Tecla y San Salvador, El Salvador. (Doctoral dissertation, Universidad de El Salvador). http://ri.ues.edu.sv/id/eprint/16493/MirandaRENajarroRANavarreteIV.2018Detección molecular de Anaplasma platys, Babesia spp., Ehrlichia canis y Hepatozoon canis en caninos (Canis lupus familiaris) con sospecha de hemoparásitos en clínicas veterinarias de Santa Tecla y San Salvador, El SalvadorDoctoral dissertation, Universidad de El Salvadorhttp://ri.ues.edu.sv/id/eprint/16493/Murrieta ZZ, Tinoco L, Hori S, López G, Tamayo AL, Barreras A. 2017. Identificación molecular de especies de los géneros Ehrlichia y Anaplasma en perros de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, México. VIIICongreso Internacional COMVEPE BC-IICV- UABC de Medicina Veterinaria en Pequeñas Especies Mexicali, B.C. https://docplayer.es/65503949-Identificacion-molecular-de-especies-de-los-generos ehrlichia-y-anaplasma-en-perros-de-la-ciudad-de-san-luis-rio-colorado-sonora- mexico.htmlMurrietaZZTinocoLHoriSLópezGTamayoALBarrerasA.2017Identificación molecular de especies de los géneros Ehrlichia y Anaplasma en perros de la ciudad de San Luis Río Colorado, Sonora, MéxicoVIIICongreso Internacional COMVEPE BC-IICV- UABC de Medicina Veterinaria en Pequeñas Especies Mexicali, B.Chttps://docplayer.es/65503949-Identificacion-molecular-de-especies-de-los-generos ehrlichia-y-anaplasma-en-perros-de-la-ciudad-de-san-luis-rio-colorado-sonora- mexico.htmlOteo JA, Nava S, Sousa R, Mattar S, Venzal J M, Abarca K, Labruna MB, Zavala J. 2014. Guías Latinoamericanas de la RIICER para el diagnóstico de las Rickettsiosis transmitidas por garrapatas. Revista chilena de infectología. 31(1):54-65. ISSN: 0716-1018. https://doi.org/10.4067/s0716-10182014000100009OteoJANavaSSousaRMattarSVenzalJ MAbarcaKLabrunaMBZavalaJ.2014Guías Latinoamericanas de la RIICER para el diagnóstico de las Rickettsiosis transmitidas por garrapatasRevista chilena de infectología31154650716-101810.4067/s0716-10182014000100009Pat H, Rodriguez RI, Bolio ME, Villegas SL, Reyes E. 2015. Molecular Diagnosis of Ehrlichia canis in Dogs and Ticks Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in Yucatan, Mexico. Journal of Medical Entomology. 52(1):101-104. https://doi.org/10.1093/jme/tju010PatHRodriguezRIBolioMEVillegasSLReyesE.2015Molecular Diagnosis of Ehrlichia canis in Dogs and Ticks Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in Yucatan, MexicoJournal of Medical Entomology52110110410.1093/jme/tju010Parola P, Rovery C, Rolain JM, Brouqui P, Davoust B, Raoult D. 2009. Rickettsia slovaca and R. raoultii in Tick-borne Rickettsioses. Emerging Infectious Diseases. 15(7):1105-1108. ISSN: 1080-6059. https://doi.org/10.3201/eid1507.081449ParolaPRoveryCRolainJMBrouquiPDavoustBRaoultD.2009Rickettsia slovaca and R. raoultii in Tick-borne RickettsiosesEmerging Infectious Diseases157110511081080-605910.3201/eid1507.081449Peniche LG, Pérez OC, Dzul RK, Zavala CJ. 2015. Rickettsiosis: Enfermedad Re- Emergente en México. Ciencia y Humanismo en la salud. 2(2):76-84. ISSN: 2395-8707. https://www.researchgate.net/profile/KarlaRossanet/publication/332707900_Rickettsiosis_Enfermedades_ReEmergente_en_Mexico/links/5cc5446da6fdcc1d49b47593/Rickettsiosis-Enfermedades-Re-Emergente-en-Mexico.pdfPenicheLGPérezOCDzulRKZavalaCJ.2015Rickettsiosis: Enfermedad Re- Emergente en MéxicoCiencia y Humanismo en la salud2276842395-8707https://www.researchgate.net/profile/KarlaRossanet/publication/332707900_Rickettsiosis_Enfermedades_ReEmergente_en_Mexico/links/5cc5446da6fdcc1d49b47593/Rickettsiosis-Enfermedades-Re-Emergente-en-Mexico.pdfPrograma Sectorial DE Salud (PSS). 2014. Prevención y Control de las Rickettsiosis. Programa de Acción Específico. México. http://www.cenaprece.salud.gob.mx/descargas/pdf/PAE_PrevencionControlRickettsiosis 2013_2018.pdfPrograma Sectorial DE Salud (PSS)2014Prevención y Control de las Rickettsiosis. Programa de Acción EspecíficoMéxicohttp://www.cenaprece.salud.gob.mx/descargas/pdf/PAE_PrevencionControlRickettsiosis 2013_2018.pdfRodríguez RI, Apanaskevich DA, Ojeda-Chi MM, Trinidad I, Reyes E, Esteve MD, Pérez AA. 2016. Ticks collected from humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, Mexico. Veterinary Parasitology. 215:106-113. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2015.11.010RodríguezRIApanaskevichDAOjeda-ChiMMTrinidadIReyesEEsteveMDPérezAA.2016Ticks collected from humans, domestic animals, and wildlife in Yucatan, MexicoVeterinary Parasitology21510611310.1016/j.vetpar.2015.11.010Rojas A, Rojas D, Montenegro D, Gutiérrez R, Yasur-Landau D, Baneth G. 2014. Vector-borne pathogens in dogs from Costa Rica: First molecular description of Babesia vogeli and Hepatozoon canis infections with a high prevalence of monocytic ehrlichiosis and the manifestations of co-infection. Veterinary parasitology. 199(3-4):121-128. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2013.10.027RojasARojasDMontenegroDGutiérrezRYasur-LandauDBanethG.2014Vector-borne pathogens in dogs from Costa Rica: First molecular description of Babesia vogeli and Hepatozoon canis infections with a high prevalence of monocytic ehrlichiosis and the manifestations of co-infectionVeterinary parasitology1993-412112810.1016/j.vetpar.2013.10.027Rojas A, Rueda A, Díaz D, Mesa NC, Benavides JA, Imbachi K, López R. 2013. Identificación de Ehrlichia canis (Donatien & Lestoquard) Moshkovski mediante PCR anidada. Veterinaria y Zootecnía. 7(1):37-48. https://www.researchgate.net/profile/Javier_Benavides_Montano/publication/314533462_Identificacion_de_Ehrlichia_canis_Donatien_Lestoquard_Moshkovski_mediante_PCR_anidada/links/58c322b892851c0ccbf14401/Identificacion-de-Ehrlichia-canis-Donatien-Lestoquard-Moshkovski-mediante-PCR-anidada.pdfRojasARuedaADíazDMesaNCBenavidesJAImbachiKLópezR.2013Identificación de Ehrlichia canis (Donatien & Lestoquard) Moshkovski mediante PCR anidadaVeterinaria y Zootecnía713748https://www.researchgate.net/profile/Javier_Benavides_Montano/publication/314533462_Identificacion_de_Ehrlichia_canis_Donatien_Lestoquard_Moshkovski_mediante_PCR_anidada/links/58c322b892851c0ccbf14401/Identificacion-de-Ehrlichia-canis-Donatien-Lestoquard-Moshkovski-mediante-PCR-anidada.pdfSánchez G, Tesouro M. 2001. Ehrlichiosis. Canis et felis. 51. ISSN: 1133-2751. https://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=ES20020018360SánchezGTesouroM.2001Ehrlichiosis. Canis et felis511133-2751https://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=ES20020018360Santamaria A, Calzada J, Saldaña A, Yabsley M, Gottdenker N. 2014. Molecular diagnosis and species identification of Ehrlichia and Anaplasma infections in dogs from Panama, Central Americ. Vector Borne Zoonotic Dis. 14(5):368-370. https://doi.org/10.1089/vbz.2013.1488SantamariaACalzadaJSaldañaAYabsleyMGottdenkerN.2014Molecular diagnosis and species identification of Ehrlichia and Anaplasma infections in dogs from Panama, Central AmericVector Borne Zoonotic Dis14536837010.1089/vbz.2013.1488Silva CB, Santos HA, Navarrete MG, Ribeiro DU, Gonzalez BC, Zaldivar MF, Pires MS, Peckle M, Costa LD, Vitari LV, Massard CL. 2016. Molecular detection and characterization of Anaplasma platys in dogs and ticks in Cuba. Ticks and Tick-borne Diseases. 7(5):938-944. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2016.04.012SilvaCBSantosHANavarreteMGRibeiroDUGonzalezBCZaldivarMFPiresMSPeckleMCostaLDVitariLVMassardCL.2016Molecular detection and characterization of Anaplasma platys in dogs and ticks in CubaTicks and Tick-borne Diseases7593894410.1016/j.ttbdis.2016.04.012Silva JN, Almeida A B, Boa E C. 2010. Seroprevalence anti-Ehrlichia canis antibodies in dogs of Cuiabá, Mato Grosso. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 19(2):108-111. https://doi.org/10.4322/rbpv.01902008SilvaJNAlmeidaA BBoaE C.2010Seroprevalence anti-Ehrlichia canis antibodies in dogs of Cuiabá, Mato GrossoBrazilian Journal of Veterinary Parasitology19210811110.4322/rbpv.01902008Sosa, CG, Quintero MT, Gaxiola SM, Cota S, Esteve MD, Gordillo MG. 2013. Frequency and clinical epidemiology of canine monocytic ehrlichiosis in dogs infested with ticks from Sinaloa, Mexico. Journal of Veterinary Medicine. https://doi.org/10.1155/2013/797019SosaCGQuinteroMTGaxiolaSMCotaSEsteveMDGordilloMG.2013Frequency and clinical epidemiology of canine monocytic ehrlichiosis in dogs infested with ticks from Sinaloa, MexicoJournal of Veterinary Medicine10.1155/2013/797019Sosa CG, Quintero T, Vargas M, Gordillo P. 2016. Primer análisis filogenético de Ehrlichia canis en perros y garrapatas de México. Estudio preliminar. Revista MVZ Córdoba. 21(3):5569-5576. https://doi.org/10.21897/rmvz.831SosaCGQuinteroTVargasMGordilloP.2016Primer análisis filogenético de Ehrlichia canis en perros y garrapatas de México. Estudio preliminarRevista MVZ Córdoba2135569557610.21897/rmvz.831Sutherst RW. 2004. Global change and human vulnerability to vector-borne diseases. Clin Microbiol Rev. 17(1):136-73. https://doi.org/10.1128/CMR.17.1.136- 173.2004SutherstRW.2004Global change and human vulnerability to vector-borne diseasesClin Microbiol Rev17113617310.1128/CMR.17.1.136- 173.2004Tanikawa A, Labruna MB, Costa A. 2013. Ehrlichia canis in dogs in a semiarid región of Northeastern Brazil: Serology, molecular detection and associated factors. Res Vet Sci. 94(3):474-477. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2012.10.007TanikawaALabrunaMBCostaA.2013Ehrlichia canis in dogs in a semiarid región of Northeastern Brazil: Serology, molecular detection and associated factorsRes Vet Sci94347447710.1016/j.rvsc.2012.10.007Tinoco GL, Lomelí MR, Hori S, Stephenson N, Foley J. 2018. Molecular confirmation of Rocky Mountain spotted fever epidemic agent in Mexicali, Mexico. Emerging Infectious Diseases, 24(9):1723-1725. https://doi.org/10.3201/eid2409.171523TinocoGLLomelíMRHoriSStephensonNFoleyJ.2018Molecular confirmation of Rocky Mountain spotted fever epidemic agent in Mexicali, MexicoEmerging Infectious Diseases2491723172510.3201/eid2409.171523Mutz I. 2009. Las infecciones emergentes transmitidas por garrapatas. Annales Nestlé. 67(3):123-134. ISSN: 0252-8185. https://doi.org/10.1159/000287275MutzI.2009Las infecciones emergentes transmitidas por garrapatasAnnales Nestlé6731231340252-818510.1159/000287275Ng-Nguyen D, Stevenson MA, Dorny P, Gabriël S, Vo TV, Nguyen V-AT, Phan TV, Hii SF, Traub RJ. 2017. Comparison of a new multiplex real-time PCR withthe Kato Katzthick smear and copro-antigen ELISA for the detection and differentiation of Taenia spp. in human stools. PLoS Negl Trop Dis. 11(7):e0005743. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005743Ng-NguyenDStevensonMADornyPGabriëlSVoTVNguyenV-ATPhanTVHiiSFTraubRJ.2017Comparison of a new multiplex real-time PCR withthe Kato Katzthick smear and copro-antigen ELISA for the detection and differentiation of Taenia spp. in human stoolsPLoS Negl Trop Dis117e000574310.1371/journal.pntd.0005743Wei L, Kelly P, Ackerson K, El-Mahallawy HS, Kaltenboeck B, Wang C. 2014. Molecular detection of Dirofilaria immitis, Hepatozoon canis, Babesia spp., Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs on Costa Rica. Acta Parasitologica. 60(1). https://doi.org/10.1515/ap-2015-0003WeiLKellyPAckersonKEl-MahallawyHSKaltenboeckBWangC.2014Molecular detection of Dirofilaria immitis, Hepatozoon canis, Babesia spp., Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs on Costa RicaActa Parasitologica60110.1515/ap-2015-0003
Clave: e2021-42.
Original ArticleMolecular detection of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii in domestic canines from the municipality of Cajeme, Sonora, MexicoABSTRACT:
Zoonoses are a worldwide problem with an impact on animal health. This group of diseases include Ehrlichiosis, Anaplasmosis and Rickettsiosis, in which their vector is the tick Riphicephalus sanguineus, commonly known as the brown dog tick. Current evidence indicates this microorganism acts as vector of bacterial zoonotic agents including Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii, which have infected a large number of dogs and humans in northern Mexico. This study was conducted in the municipality of Cajeme, Sonora, using blood samples (n=170) from canine. Molecular techniques were used to detect 92 samples positive for Ehrlichia spp., 47 for Ehrlichia canis, 18 for Anaplasma platys and 2 for Rickettsia spp. In addition, co-infection with Ehrlichia canis was found in 12 samples positive for Anaplasma platys. Sequencing of one positive of each bacterium was performed, obtaining 100% homology in the "GenBank" platform (NCBI). Our results emphasized the importance of the zoonotic impact and co-infection of these diseases. Moreover, this is the first study confirming the molecular identification of the species Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii, as well as their co-infection, in domestic dogs located in the municipality of Cajeme, Sonora.
Zoonoses involve several diseases that represent a significant worldwide problem affecting human and animal health (García et al., 2013). Such diseases include Ehrlichiosis, Anaplasmosis and Rickettsiosis which are caused by a gramnegative bacteria characterized by intracellular obligated growth (genus Rickettsia, family Rickettsiaceae; genus Ehrlichia and Anaplasma, family Anaplasmataceae). These are mainly transmitted by ectoparasites, including Riphicephalus sanguineus, the brown dog’s thick, which affect ground vertebrates (Parola et al., 2009; Alvarez, 2017). Several studies have demonstrated these ectoparasites act as vectors from zoonotic agents including Erlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii (Gaunt et al., 2010).
E. canis causes a zoonotic disease in dogs, cats and rodents; then, the human is an accidental victim after being stung by the Rhipicephalus stick hosted in these animals. After the infection, the microorganism is incubated during 1-2 weeks and enters into the blood and lymphatic vessels; then, it travel to the spleen, liver and lymph nodes to be multiplied by binary fusion for spreading to other body organs (Castro et al., 2004).
E. canis is considered as a bacterium of cosmopolitan distribution. In Mexico, it was first described in 1996 and classified as endemic because it has been reported in the whole country, but mainly in northwest states such as Sonora and Sinaloa. In Sonora, E. canis is considered as a health emergency and a growing public health issue. Since 2002, more than 600 cases have been reported, the vast majority in municipalities in the north of the state (Álvarez, 2017; Sosa et al., 2013).
Clinical signs of the acute phase of the disease are hematologic alterations, leukopenia, thrombocytopenia and mild to moderate anemia; the chronic phase is characterized by thrombocytopenia, epistaxis, nephropathy, dyspnea, hepatomegaly, splenomegaly or lymphadenopathy, inflammatory or hemorrhagic meningitis, among others (Ismail et al., 2010).
A. platys is distributed worldwide and it is also transmitted by the ticks R. sanguineus. It was first described in 1978 in dogs from United States (Sánchez & Tesouro, 2001). This bacteria belong to the Anaplasma genus (Ábrego et al., 2009). It causes canine infectious cyclic thrombocytopenia. The disease may present with fever, anorexia, petechiae, uveitis, generalized lymphadenopathy, leukopenia, moderate anemia and especially thrombocytopenia, occurring in episodes of 3-4 days at intervals of 7-21 days, eventually leading to chronic thrombocytopenia with slow recovery (Cicuttin et al. 2014).
Currently, A. platys has been detected with low incidence in the states of Coahuila, Durango and Sonora (Almazán et al., 2016; Murrieta et al., 2017). As zoonotic disease, Arraga et al. (2014) reported two women in Venezuela who were exposed to R. sanguineus. Intraplatelet inclusion bodies suggestive of A. platys were subsequently observed in smears and A. platys DNA was amplified and sequenced from whole blood, although treatment with doxycycline did not alleviate their symptoms. These cases provide additional support for A. platys as a tick-borne zoonotic pathogen, most likely of low pathogenicity; however, the cause of A. platys disease in humans has not been confirmed.
R. rickettsii is the main agent of spotted fever in the Americas; cases have been reported in the U.S., Canada, Mexico, Costa Rica, Panama, Colombia, Brazil and Argentina (López et al., 2007; Herrero et al., 2010; Lebruna et al., 2011), with a high mortality rate due to late detection of the pathogen (Oteo et al., 2014). It is considered that Mexico has the ideal conditions for the transmission cycle of the disease, commonly associated with living conditions (poverty) since most of the cases presented have been detected in marginalized and rural areas of Mexico (Peniche et al., 2015). Recent studies demonstrated the presence of Rickettsia spp. in ticks from the state of Sonora by PCR technique (Foley et al., 2019).
These pathogens could be present previously in the tick, causing simultaneous co- infections in the host (i.e. more than one agent can be transmitted), which will be causing the disease at the same time. This can result in the manifestation of clinical signs, in a more severe and non-specific way, being a disadvantage for the clinical diagnosis by human and veterinary physicians attending these cases (Alleman & Wamsley, 2008; Mutz et al., 2009).
Considering the zoonotic importance of these diseases, and that no previous studies have been reported in the municipality of Cajeme, Sonora, the presence of vectors of E. canis,
A. platys and R. rickettsii in domestic dogs in the municipality is suggestive of the presence of these zoonotic diseases. Therefore, the objective was the molecular identification of the species E. canis, A. platys and R. rickettsii to determine their co-infection in domestic dogs in the municipality of Cajeme, Sonora.
MATERIAL AND METHODSType of study
A descriptive observational study was conducted to detect the presence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii.
Study area
The present work was carried out from blood samples of dogs sent to the Laboratory of Molecular Biology of Veterinary Medicine and Zootechnics of the Technological Institute of Sonora, coming from private veterinary clinics in the town of Cajeme in the state of Sonora, Mexico.
Experimental sampling
We used 170 canine whole blood samples with EDTA anticoagulant from a commercial veterinary diagnostic laboratory located in Ciudad Obregon, Sonora. Only canines with presumptive clinical diagnosis or positive for E. canis, A. platys and R. rickettsii were selected based on the symptomatology presented and complementary analyses performed, such as blood smears and hemograms. The samples were transported to the Veterinary Molecular Biology Laboratory at ITSON and in all cases were kept at 4°C until their final processing, for a period of no more than 24 hours.
Blood sample processing
The samples were thawed and centrifuged for 15 minutes at 3,500 rpm in order to obtain 200 µl of leukoplatelet layer and start the extraction of the genetic material.
Extraction of bacterial DNA
For DNA extraction from blood samples, the commercial DNeasy Blood and Tissue Kit (QIAGEN®) were used following the manufacturer's instructions. The quantity, quality and purity of DNA were measured in an automatic spectrophotometer BioSpect-nano (Shimadzu), and the integrity was observed in 1.5% agarose gel stained with 1.5 µl ethidium bromide.
Synthesis of positive controls
The BLASTn GenBank® tool of the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database was used to download the sequences obtained from the alignments. Such alignments were performed using the specific primers of the bacteria Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii, in FASTA format. We used 50 bp upstream from the first forward and 50 bp downstream from the first reverse where the oligonucleotides were aligned. The sequences were entered into the IDT (Integrated DNA Technologies) platform for the synthesis of the gBlocks™ gene fragments, facilitating standardization for PCR detection of each of the microorganisms under study.
Amplification by PCR
The DNA samples were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) using the primer sets described in Table 1. Initially, PCR assays targeted the genera Eherlichia spp., Anaplasma spp. and Rickettsia spp. Samples that tested positive for each genus were subjected to their second PCR with primers specific for E. canis, A. platys and R. rickettsii. For the reactions was used the GoTaq® Flexi DNA Polymerase PCR preloaded kit (Promega) containing Green GoTaq®, which serves as reaction buffer and gel loading solution, allowing to load reactions directly for fast and efficient analysis. Reactions were run in a final volume of 25 μl, starting with the manufacturer's concentrations: 1X Green GoTaq Buffer 5x, 1.5mM MgCl2, 0.2 mM for each dNTP, 0.4 μM of each primer, 1.25u of GoTaq DNA Polymerase, 2 μl of DNA and nuclease-free H2O to 25 µL. The product was identified on 1.5% agarose gel and ethidium bromide, considering positive bands with the size of each agent.
Primers used for agent detection in canine blood samples
Sequencing and in silico analyses of amplified fragments
A PCR product from each microorganism that was positive, it was also purified with the commercial kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) to corroborate that the amplified fragment belongs to the regions of interest. Amplicons were then sequenced using the Sanger process performed at Langebio Cimvestav Lab Irapuato unit. The fragments generated with nucleotide sequences representative of each bacterium were analyzed with the Snapgene Viewer program, and subjected to the BLASTn algorithm to evaluate the percentage of homology of each agent with the sequences available in the GenBank database.
RESULTS
It was observed by electrophoresis that all the extracted DNA showed a good integrity of the molecules and yielded an average quantification by spectrophotometry of 248.32 ng/µl in the leukoplatelet layer samples. A purity value of 1.85 measured through the ratio 260- 280 indicate the DNA as “pure”, using samples from whole blood with EDTA.
For the PCR technique, a concentration of 0.5 ng/µl of each gblocks was used as positive controls, obtaining the corresponding base pairs of each agent, achieving good efficiency and speed for molecular standardization.
The number of positive cases and frequency of Ehrlichis spp., Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia spp. obtained from molecular analysis of canine blood samples (n=170) are described in Table 2. Of the 92 samples that tested positive for Ehrlichia spp. 12 co-infections (Table 3) of Ehrlichia canis with Anaplasma platys (Genus EA) were found (13%).
Number of cases and frequency of <italic>Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsi</italic> in dogs from Cajeme, Sonora, by PCR (n = 170)
Agente
PCR
Positives
Frequency
Ehrlichia spp
92
54%
Ehrlichia canis
47
28%
Anaplasma platys
18
11%
Rickettsia spp.
2
0.8%
Co-infections and frequency in positive dogs to the genus EA
Co-infecciones
PCR
(E. canis / A. platys)
Positives 92
Positives
12
Frequency
13%
In addition, sequencing of 1 sample of each positive for the different species of microorganisms analyzed was performed, obtaining pure chromatograms analyzed with the SanpGene Viewer program. The analysis of the sequences in the BLASTn program (National Center for Biotechnology Information) detected a similarity between 99 and 100% with the previously reported sequences.
DISCUSSION
Microorganisms of the order Rickettsiales have zoonotic conditions called Rickettsiosis, Ehrlichiosis and Anaplasmosis that are due to several pathogens of veterinary importance that have gained ground not only in our region but also worldwide (Rodríguez et al. 2016), this is mainly due to its vector Rhipicephalus sanguineus, being the most commonly reported tick species and with the greatest geographic distribution (Sosa et al., 2016; Cabezas-Cruz et al., 2019). These pathogens are increasing due to the activity of human beings that has generated radical changes in the environment, favoring vector-borne diseases (Suthers, 2004) and increasing their prevalence in late spring and summer. Due to the fact that these ectoparasites increase their activity in high ambient temperatures during these seasons of the year, inoculating the mentioned hemoparasites more quickly (Parola et al., 2009), necessitating the standardization of precise techniques for the detection of these zoonotic microorganisms of the Rickettsiales order in Tropicales and Subtropicales regions.
Currently using gBlocks gene fragments as positive controls used in this study have become popular as standards and synthetic positives for the detection of bacterial microorganisms. Currently similar data were reported in Barcelona where this type of fragments were used for detection of E. coli, E. faecalis and Legionella pneumiphilia (Cardenas, 2018); also, in Australia such fragments were used as standards in the multiplex PCR detection of Taenia spp. (Ng-Nguyen et al., 2017) Therefore, the use of gBlocks for PCR standardization is recommended as it increased the speed of the bioassay in detection due to the lack of availability of biological isolates.
The study was the first work using PCR to detect the species Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsi in blood samples from dogs in the municipality of Cajeme and in Sonora, allowing to know the expanded geographical distribution of the three pathogens in the state. The percentage of 54% to at least one pathogenic agent in our study agrees with investigations performed using molecular tools in some South and Central American countries, where Brazil reported 69% (Tanikawa et al., 2013), Nicaragua 80% (Wei et al., 2014), Panama 70.6% (Santamaria et al., 2014), Costa rica 45% (Rojas et al., 2015) and El Salvador 60% (Miranda et al., 2018). Our prevalence percentage differed when was compared with high percentages of other countries, probably because they worked with dogs without owners and being more in contact with the vector of the diseases as it is associated with living conditions in marginalized areas (Peniche et al., 2015). Prevalence to hemoparasites have been reported in some other states of Mexico, where Sinaloa reports 74.3% (Sosa-Gutiérrez et al., 2013), Coahuila and Durango 41% (Almazán et al., 2016), Yucatán 69% (Díaz et al., 2016), Chihuahua 40% (Escárcega et al., 2018) and Sonora 33% (Murrieta et al., 2017). As early mentioned, Cajeme yielded 57% of infection, positioning Sonora at this time as one of the main states with the highest incidence in tropical and subtropical regions where parasites and the vector are present.
Regarding the percentage of presence of each hemoparasite, our study evidenced the higher prevalence of E. canis reported in Mexico (28%). Other studies reported lower results. In the municipality of San Luis Rio Colorado, 8% of infection for E. canis was found in blood samples from 235 dogs (Murrieta et al., 2017); also, in the State of Coahuila and Durango 10% was found in a population of 100 healthy dogs infested with ticks (Almazán et al., 2016). In Yucatan, 36% was determined in a population of 50 dogs (10 domestic dogs and 40 in an animal control center), where all positive dogs were from samples collected from the animal shelter, representing a prevalence of 45% for this sampling site (Path et al., 2015). There are also findings in other countries such as Buenos Aires, Argentina, where the results were similarly lower in a population of 223 dogs, obtaining 6.7% of positives to E. Canis (Cicuttin, 2016), Uruguay is one of the few countries which reported the presence of other hemoparasites, but not the presence of E. Canis in a population of 191 dogs (Carvalho, 2017). In contrast to Brazil, the percentage in our study was lower because the worked with 472 dogs in the Brazilian northeast detecting 34.5% of positive dogs (Silva et al., 2010), Colombia represents the largest area with high prevalence reviewed on E. canis, mainly the municipalities of Palmira (92.8%) and Cartago (90%) (Rojas et al., 2013). However, it is worth mentioning that this work was performed on stray dogs unlike our study.
The presence of Anaplasma platys (11%) in our study, turned out to be higher than those reported in Buenos Aires, Argentina of 223 dogs, being positive for A. platys 7.2% (Cicuttin, 2016). In Uruguay, out of 191 dogs, 4.2% were positive (Carvalho, 2017). Also in San Luis Rio Colorado, Sonora in 235 canine samples were positive for 18% (Murrieta et al., 2017). Other publications show similar values to Costa Rica with 10% (Wei et al., 2014), Nicaragua 13% (Rojas et al., 2014), Cuba 16% (Silva et al., 2016) and El Salvador with 17% (Murrieta, 2017), but proved to be lower with respect to Panama with 21.3%. In Brazil, in a population of 100 dogs, a higher prevalence was obtained for Anaplasma platys with 21% and 9% for Ehrlichia, being one of the few studies that differs in our results, since, in our work and most of the research conducted in Central and South America, they report a lower incidence of A. platys than E. canis.
The molecular diagnosis in our research of hemoparasites related to Ehrlichia and Anaplasma has been easy to identify, unlike the bacterium Rickettsia rickettsii with the PCR technique from blood samples in canines. Our prevalence percentage to this agent was lower (0.8%) compared to E. canis and A. platys, this may be because it is typically mentioned that low numbers of rickettsiae circulate in the blood in the absence of advanced disease or fulminant infection (CDC, 2017; Tinoco et al., 2018).
Due to this we found in the literature different investigations, mostly directed to the diagnosis of Rickettsia spp. and R. rickettsii in R. sanguineus ticks in dogs from different regions, as is the case of Yucatan, selected 28 dogs where 106 Rhipicephalus sanguineus ticks were collected with a 26% incidence (Peniche et al., 2015) In Matamoros, Coahuila, the endpoint PCR technique was performed for the analysis of 100 ticks (Rhipicephalus sanguineus) giving as positive to Rickettsia spp 4% of the samples analyzed (Castillo et al., 2015). In Mexicali Baja California, Mexico, dog ticks belonging to the morphology of Rhipicephalus sanguineus were analyzed by means of PCR, resulting in positive samples with 100% homology to R. rickettsii (Foley et al., 2019). Currently Sonora leads the entities with the most reports of Rickettsiasis in the country, being Cajeme one of the main cities with more cases of death, despite being a data associated with public health, it is important to know the incidence of R. rickettsii in animals (PSS, 2014), giving greater importance to our work, because not only Rickettsia spp. but R. rickettsii was also detected, with 100% homology to the genus with the gltA gene and the species with the OmpA gene in blood samples from 2 dogs (n = 170), these genes are the most used for the detection of the bacteria that cause spotted fever.
The results obtained from the three agents, increases the alert and the incidence of cases associated with Rickettsiales in the state of Sonora transmitted by the brown tick Riphicephalus sanguineus. It is currently the most important vector of Rickettsiales in Mexico (Labruna, 2009), constituting a public health problem, since R. rickettsii, E. canis and A. platys are considered zoonotic disease by the CDC in 2017 and that over the years have acquired greater territory of infection. As mentioned above, these pathogens can be present in the tick, causing simultaneous co-infections in the host, i.e. more than one single agent can be transmitted, as demonstrated in the present investigation, finding 13% of co-infection to the agents E. canis and A. platys.
The presence of co-infection with these bacteria in our study is not a strange finding, since they are the most common in Latin America. In our study we have similar percentages obtained in Panama, which report a co-infection between E. canis and A. platys of 7.5% (Santamaría et al., 2014), El Salvador with 4.5% (Miranda et al., 2018) and San Luis Rio Colorado, Sonora with 12.2% (Murrieta et al., 2017), mentioning that the latter is very similar to our co-infection results and is from the same state.
It is essential to consider that the remaining 46% of the negative samples in the study to genus and species, may be due to the absence of the pathogens or the presence of other diseases, because in the investigation all blood samples came from presumptive dogs or manifested clinical symptoms, although it may also be due to the presence in undetectable low quantities of the pathological agents.
Finally, it is important to highlight that the differences found between the samples positive to genus and negative to E. canis, A. platys and R. rickettsi species are probably due to the fact that the primers used in the first genus PCR (ECC/ECB) also amplify other species, which could indicate infection by other Ehrlichia species (E. ewingii or others) or other species of the Anaplasmataceae family (A. phagocytophilum or others).
CONCLUSIONS
The percentage of haemoparasites in domestic dogs reported in this study, currently positions Sonora as one of the main states with the highest frequency in tropical and subtropical regions. The three agents were detected by molecular technics in the blood of suspected dogs from the city of Cajeme, Sonora, identifying Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii with frequencies of 28%, 11% and 0.8%, respectively. In addition, these three agents were confirmed by sequencing. Regarding co-infections, only Ehrlichia canis and Anaplasma platys were detected simultaneously with 13% of frequency.
To our knowledge, this is the first molecular identification investigation in our state, confirming the presence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Rickettsia rickettsii starting from whole blood of canines. However, further studies are suggested to explore the frequency of these infectious agents in other regions from the state on Sonora.