av Abanico veterinario Abanico vet 2007-428X 2448-6132 Sergio Martínez González 10.21929/abavet2021.36 00126 Artículos originales Evaluación de la adición de quercetina y vitamina E al medio de criopreservación de semen ovino sobre la fertilidad in vivo 0000-0003-0847-529X Jiménez-Aguilar Eduardo * 0000-0003-0758-9762 Quezada-Casasola Andrés 1 0000-0001-8872-6209 Prieto-Caraveo Mario 2 0000-0003-3238-2341 Orozco-Lucero Ernesto 1 0000-0003-0313-586X Itzá-Ortiz Mateo 1 0000-0002-6899-9485 Carrera-Chávez José ** 1 Departamento de Ciencias Veterinarias, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Ciudad Juárez, Chihuahua, México. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Instituto de Ciencias Biomédicas Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Ciudad Juárez Chihuahua Mexico Animal Health and Inspection Service, U.S. Departament of Agriculture. El Paso, Texas, USA. Animal Health and Inspection Service El Paso Texas USA Autor responsable. Autor de correspondencia: Carrera-Chávez José, Anillo envolvente y Estocolmo, Ciudad Juárez, Chihuahua, México CP 32310. Correo: jose.carrera@uacj.mx, al182903@alumnos.uacj.mx, aquezada@uacj.mx, mario.a.prieto@usda.gov, ernesto.orozco@uacj.mx, mateo.itza@uacj.mx 28 02 2022 Jan-Dec 2021 11 e126 11 06 2021 30 09 2021 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN:

La criopreservación induce estrés oxidativo que tiene efectos adversos en la calidad post-descongelado del semen. El objetivo fue evaluar el efecto de la adición de quercetina al medio de criopreservación de semen ovino. El semen se colectó de tres sementales ovinos mediante vagina artificial, y se utilizó un diluyente comercial. Los tratamientos fueron: control; quercetina 200 µM; vitamina E 100 µM; y la combinación de quercetina y vitamina E. Se evaluó la vitalidad, motilidad, integridad del acrosoma y fertilidad in vivo. Las variables numéricas se analizaron con un ANOVA y la tasa de gestación con ji cuadrado. En la evaluación de las características espermáticas de motilidad no se encontró diferencia significativa entre tratamientos. El tratamiento con mayor porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto fue quercetina 200 µM (22.33±2.51%) comparado con los demás tratamientos (P<0.05). La fertilidad in vivo no fue estadísticamente significativa, pero se encontró una diferencia numérica en el porcentaje de gestación con la adición de 200 µM de quercetina (51.92%) en comparación a los demás tratamientos. En conclusión, la adición de 200 µM de quercetina al medio de criopreservación de semen ovino mejoró la vitalidad e integridad del acrosoma, pero no el porcentaje de fertilidad in vivo.

 Palabras clave: antioxidante congelación tasa de gestación características espermáticas Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología Universidad Autónoma de Ciudad Juárez INFR201501- 251729 UACJ- PIVA 312-17-15 INTRODUCCIÓN

El objetivo de la criopreservación es mantener la viabilidad y funcionalidad de los espermatozoides a bajas temperaturas; sin embargo, esta provoca daños y deficiencias en los espermatozoides. Al momento de la criopreservación, los espermatozoides se exponen a impactos físicos y químicos que dificultan la viabilidad, disminuyen la motilidad, dañan el acrosoma y disminuyen su fertilidad (Mata-Campuzano et al., 2015). Esto se debe en parte al hecho de que la criopreservación induce estrés oxidativo, como resultado de la formación excesiva de especies reactivas al oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés; El-Khawagah et al., 2020), ya que los ácidos grasos poliinsaturados de la membrana son susceptibles al daño por ROS, y el citoplasma de los espermatozoides contiene bajas concentraciones de las enzimas que capturan los radicales libres (Karimfar et al., 2015).

La adición de antioxidantes en los diluyentes para la congelación de semen produce una mejora en las características post-descongelación, ya que protegen a los ácidos grasos poli-insaturados de los espermatozoides, previniendo así el daño por estrés oxidativo. Se ha demostrado que numerosas plantas tienen un efecto antioxidante, ya que contienen flavonoides con capacidades antioxidantes como la quercetina, y vitaminas antioxidantes como C, E y A (Berkovich et al., 2013). La quercetina es un flavonoide antioxidante comúnmente presente en vegetales, capaz de eliminar las ROS (El-Khawagah et al., 2020) y se ha reportado que mejora la calidad del semen de borrego post-descongelación (Silva et al., 2012; Gibb et al., 2013). La vitamina E es un antioxidante lipofílico que protege los ácidos grasos insaturados contra la peroxidación, ya que es un potente eliminador de radicales peroxilo y un inhibidor importante de la reacción en cadena de lipo-peroxidación en animales (Allai et al., 2018), y es comúnmente utilizado como antioxidante en la criopreservación de semen (Abdi-Benemar et al., 2015; Benhenia et al., 2016).

En comparación con otras técnicas de inseminación, la inseminación artificial por laparoscopia se utiliza como alternativa para la utilización de semen criopreservado, ya que los daños que ocurren en los espermatozoides al momento de la criopreservación limitan la fertilidad post-inseminación con técnicas vaginales o cervicales (Allai et al., 2018). Sin embargo, no se tiene ningún reporte de la evaluación de la fertilidad in vivo tras la adición de antioxidantes como la quercetina y la vitamina E en semen criopreservado de ovino. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la adición de quercetina en el medio de criopreservación de semen ovino sobre características espermáticas y fertilidad in vivo.

 MATERIAL Y MÉTODOS Área de estudio y animales

El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación y Reproducción Animal de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ). La inseminación artificial se realizó en una granja ubicada en Ciudad Juárez en las coordenadas 31°43'12.9" N y 106°27'39.0" O, al norte del Estado de Chihuahua. El procesamiento del semen y la inseminación artificial se realizaron durante la época reproductiva (julio a febrero).

El semen se colectó de tres sementales de la raza Katahdin, con una edad aproximada de tres años, con una condición corporal de 4 (escala de 1-5). Para evaluar la fertilidad del semen criopreservado, se inseminaron 201 hembras de encaste racial de pelo (Katahdin, Pelibuey, Blackbelly), con una edad entre 2 y 4 años de edad y una condición corporal entre 2 y 4 de la escala 1-5. Los animales fueron alimentados con alfalfa, concentrado comercial y agua ad libitum. Todos los procedimientos en el presente estudio se realizaron de acuerdo a las técnicas de cuidado animal y salud en México (NOM-051- ZOO-1995) y con la aprobación del Comité Institucional de Ética y Bioética de la UACJ (CIEB-2019-1-093).

 Colección de semen y evaluación pre-criopreservación

Se trabajó individualmente cada uno de los sementales para la colección de semen, con la técnica de vagina artificial. Una vez recolectadas las muestras, fueron conservadas a baño maría a 37.5 °C (Presicion Water 282, Thermo Scientific, EUA) mientras se colectaban y evaluaban las tres muestras. La colección de semen se realizó dos veces por semana, durante seis semanas. Se evaluaron 12 eyaculados por borrego, con un total del 36 eyaculados evaluados.

La evaluación pre-criopreservación se realizó tomando 10 µL de cada muestra mediante una pipeta (Magnetic-Assist Pipette, Rainin, EUA), la cual se depositó en una cámara de recuento estándar de 20 µm (Cámara Leja, Leja Products, Holanda), para ser evaluada mediante un análisis de semen asistido por computadora (CASA; AndroVision, Minitube, Alemania) con un microscopio vertical (AxioScope.A1, Zeiss, Alemania). Se evaluó la motilidad progresiva (%) y la concentración espermática (células/mL). Se establecieron como niveles mínimos requeridos para congelar: volumen del eyaculado ≥ 0.5 mL, motilidad progresiva ≥ 80%, y una concentración de 3x109 espermatozoides/mL (Câmara et al., 2011).

 Dilución y procesamiento del semen

Los eyaculados se procesaron individualmente, ya que se utilizaron para la inseminación artificial. Se realizó un protocolo de dilución con un diluyente comercial (Two Step; Continental Plastic Corp., EUA) con 6% de glicerol (v/v) y 10% de yema de huevo (v/v). La dilución se trabajó a una temperatura de 37 °C. El eyaculado obtenido se diluyó hasta obtener una concentración de 120x106 espermatozoides mótiles por mL. Una vez diluido, el semen se envasó en pajillas de 0.25 mL, con una concentración de 30x106 espermatozoides motiles por pajilla, y se almacenó a 5 °C por dos horas. Una vez que las pajillas fueron refrigeradas y equilibradas a 5 °C, se colocaron en una hielera a 5 cm del espejo de nitrógeno durante 10 minutos, luego se dejaron caer al nitrógeno y se dejaron reposar por 5 minutos. Después, las pajillas fueron colocadas en un termo criogénico para su conservación; permanecieron ahí hasta el momento de su análisis y posteriormente para su uso en la inseminación artificial por laparoscopia.

 Tratamientos

Las muestras diluidas se fraccionaron en cuatro porciones similares y se realizaron cuatro tratamientos: tratamiento control, se realizó de forma convencional; tratamiento quercetina (Q), se adicionaron 200 µM de quercetina (Q4951, Sigma Aldrich, EUA); tratamiento vitamina E (VE), se adicionaron 100 µM de vitamina E (47786, Sigma Aldrich, EUA); y tratamiento Q + VE, se adicionó una combinación de quercetina (200 µM) y vitamina E (100 µM).

 Descongelación de las muestras seminales

El descongelamiento del semen se llevó a cabo colocando cada pajilla en baño maría (Presicion Water 282, Thermo Scientific, EUA) a 37.5 °C durante 40 segundos. Para evaluar las características seminales y la integridad del acrosoma, se seleccionaron y descongelaron al azar un total de seis pajillas por cada tratamiento por borrego (24 pajillas).

 Evaluación de características seminales post-descongelación

Para evaluar las características seminales se colocaron 10 μL de semen en la cámara de recuento estándar para evaluar motilidad (%), motilidad progresiva (%) y motilidad rápida (%), mediante el sistema CASA. En el Cuadro 1 se indica la configuración del sistema CASA utilizado para evaluar el semen de borrego.

Configuración del sistema CASA<sup>*</sup> utilizado para evaluar el semen de borrego
Variable Configuración
Resolución horizontal/vertical 1024 pixeles x 1024 pixeles
Tamaño del pixel horizontal/vertical 5.5 µm x 5.5 µm
Cuadros por segundo Arriba de 101 cuadros por segundo
Área 10-100
Detección de la cola 5 µm
Profundidad de la cámara 20 µm
Relación del pixel 0.54 µm
Volumen de referencia
Ancho 555.12 µm
Alto 555.12 µm
Espermatozoides in-motiles ALC < 20.00 µm s-1 y FBC < 10.00 µm s-1
Motilidad
Motilidad local VCL < 20.00 µm s-1 y VLR < 10.00 µm s-1
Motilidad progresiva
Motilidad circular Radio > 10.00 µm s-1 a < 80.00 µm s-1 y rotación > 0.70 µm s-1
Motilidad lenta VCL < 80.00 µm s-1
Motilidad rápida VCL < 80.00 µm s-1

Androvision, Minitube, Alemania.

ALC, amplitud de desplazamiento lateral de la cabeza; FBC, frecuencia de batido de la cola; VCL, velocidad curvilínea; VLR, velocidad en línea recta.

Evaluación del daño en la membrana acrosomal

Se tomaron 10 μL de la muestra de semen y se depositaron en un microtubo de 1 mL (Eppendorf, Alemania) y se mezcló con 10 μL del reactivo azul tripano (T8154, Sigma Chemical Co., EUA), y se colocaron 10 μL de la mezcla en un portaobjetos para realizar un frotis. Posteriormente, el frotis se fijó con etanol por dos minutos, se enjuagó con agua destilada y se dejó secar. Una vez terminada la fijación, los portaobjetos se colocaron en un recipiente con tinción Giemsa (48900, Sigma Chemical Co., EUA) donde permanecieron 18-20 horas. Después, el portaobjetos se enjuagó para eliminar el exceso de colorante con agua destilada y se dejó secar. La evaluación de la tinción de las células espermáticas se realizó por microscopía óptica a 100X (PrimoStar, Carl Zeiss, Alemania). Para obtener una media representativa de cada pajilla, se realizaron tres frotis por pajilla haciendo un conteo de 100 espermatozoides por frotis. Los espermatozoides se clasificaron en tres tipos: espermatozoides vivos con acrosoma intacto (teñidos color purpura en la región acrosomal), espermatozoides vivos con acrosoma dañado (sin acumulación de color púrpura en la región acrosomal) y espermatozoides muertos (citoplasma teñido color azul).

 Inseminación artificial por laparoscopia y diagnóstico de gestación

El estro de las ovejas se sincronizó utilizando esponjas intravaginales (Cronogest CR®, Intervet International, Holanda) impregnadas con 40 mg de acetato de fluorogestona por 12 días. Al retiro de la esponja, se aplicaron 200 UI de gonadotropina coriónica equina (Novormon® 5000, Virbac, Argentina) a cada oveja. La detección de estro se realizó introduciendo un semental sujeto con una cuerda (sin permitir la monta a la hembra) a un corral con las hembras previamente sincronizadas, 16 h previas a la inseminación (Alhamada et al., 2017). Las hembras en estro se inseminaron 55 h después del retiro de la esponja por medio de la técnica de laparoscopia. Antes de la inseminación, las pajillas se descongelaron en un termo para descongelar (Cito Products Incorporated, EUA) a 37.5 °C por 40 segundos. El semen se aplicó vía intrauterina con ayuda de un laparoscopio (250 W Halogen, Wolf, EUA) y un áspic (Aspic, IVM, Francia). La dosis de inseminación (0.25 mL) se repartió equitativamente en ambos cuernos uterinos. Se inseminaron 201 ovejas, repartidas por tratamiento de la siguiente manera: control, 50 ovejas; quercetina (Q), 52 ovejas; vitamina E (VE), 50 ovejas; y tratamiento Q + VE, 49 ovejas.

El diagnóstico de gestación se realizó mediante ultrasonido con un transductor lineal 6.5 MHz (Kaixin, Xuzhou Kaixin Electronic Instrument CO., China), vía rectal, 35 días después de la inseminación, independientemente del tratamiento realizado en el diluyente utilizado para la criopreservación del semen. La fertilidad (tasa de gestación) se determinó obteniendo el porcentaje de hembras que resultaron gestantes del total de hembras inseminadas por tratamiento.

 Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SAS 9.0 (Inst. Cary, NC, Estados Unidos de América). Los datos porcentuales se transformaron en arcoseno antes del análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza usando el procedimiento Modelo Lineal General para las variables numéricas: motilidad, motilidad progresiva, motilidad rápida, e integridad del acrosoma. La comparación de las medias entre los tratamientos se realizó mediante la prueba de Duncan. Para la tasa de gestación se utilizó la prueba de ji cuadrado. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas al nivel de P < 0.05.

 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados del efecto de los diferentes tratamientos sobre las características espermáticas de motilidad evaluadas se muestran en el Cuadro 2. En el estudio, ningún tratamiento presentó diferencia significativa estadísticamente (P > 0.05) en las variables de motilidad, motilidad progresiva y motilidad rápida. No obstante, numéricamente, el tratamiento que presentó mayor porcentaje de motilidad (71.57%) y motilidad progresiva (68.13%) fue el tratamiento de quercetina comparado con los otros tratamientos. Sin embargo, en la variable motilidad rápida, el tratamiento con mayor porcentaje (numéricamente) fue el tratamiento vitamina E con 31.48 %.

Efecto de la adición de quercetina y vitamina E sobre las características espermáticas de motilidad de semen criopreservado de ovino (Media ± desviación estándar)
Tratamiento Motilidad (%) Motilidad progresiva (%) Motilidad rápida (%)
Control 67.20±20.82 a 63.52±21.31 a 26.65±16.68 a
Q 71.57±6.40 a 68.13±6.57 a 27.31±8.22 a
Vit E 69.36±11.41 a 65.92±12.62 a 31.48±13.15 a
Q + Vit E 60.07±13.16 a 53.95±14.50 a 16.93±8.72 a

Distintas literales entre filas indican diferencia estadísticamente significativa (P < 0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.

Como se mencionó, la criopreservación induce estrés oxidativo como resultado la formación de ROS en exceso, lo cual afecta la estructura de los espermatozoides, y afecta en las características espermáticas, provoca daño en el ADN, lípidos y proteínas que le dan protección a la estructura de los espermatozoides, ya que altera los sistemas enzimáticos y las vías de señalización celular, lo cual puede provocar la muerte de las células. Los daños espermáticos causados por ROS ocurren al momento de la criopreservación y la descongelación, e incluso durante el almacenamiento en nitrógeno líquido. Es importante mencionar que los espermatozoides normalmente generan pequeñas cantidades de ROS que son importantes para diferentes procesos fisiológicos de los espermatozoides como capacitación, hiperactivación y fecundación del ovocito (Mata-Campuzano et al., 2015; Aitken, 2017); sin embargo, una vez que estos niveles fisiológicos sobrepasan los mecanismos de control oxidante, se ocasiona el estrés oxidativo (El-Khawagah et al., 2020). Por lo anterior, para reducir el daño provocado por los efectos negativos de las ROS, diversos autores han propuesto la suplementación de antioxidantes a los medios de congelación, como la vitamina E y quercetina. Por ejemplo, Sarlós et al. (2002), Silva et al. (2012)), y Abdi-Benemar et al. (2015) han evaluado la adición de vitamina E a los medios de criopreservación de semen de ovinos, y reportan efectos favorables en la integridad acrosomal, vitalidad y motilidad. Sin embargo, en el presente estudio, no se encontró un efecto favorable de la adición de vitamina E como antioxidante en las variables de motilidad evaluadas. Estos efectos contradictorios de la adición de vitamina E pueden deberse a diferentes componentes de los diluyentes, ya que Sarlós et al. (2002) mencionan que el efecto de la vitamina E varía en respuesta al azúcar y amortiguador utilizado en los diluyentes; esto también podría explicar porque en el tratamiento donde se combinó la vitamina E y la quercetina tampoco existió un efecto favorable en las variables evaluadas. En el presente estudio, el diluyente utilizado contiene fructuosa como fuente de energía y tris aminometano (TRIS) como amortiguador y Sarlós et al. (2002) indican que la adición de vitamina E es más efectiva cuando los diluyentes basados en sacarosa contienen glucosa y TRIS.

De la misma forma, se ha reportado que la adición de quercetina en los medios de criopreservación de semen de diferentes especies produce efectos favorables en la motilidad e integridad acrosomal (Gibb et al., 2013; Seifi-Jamadi et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2017; Ahmed et al., 2019; El-Khawagah et al., 2020), aunque algunos autores han reportado que no existen efectos positivos de la adición de quercetina (Silva et al., 2012; Banday et al., 2017) o incluso reportan efectos negativos (Restrepo et al., 2016). En el presente estudio, aunque la adición de quercetina no mostró una diferencia estadística en las variables de motilidad evaluadas, mostró un mayor porcentaje (numéricamente) en comparación con los demás tratamientos en las variables motilidad y motilidad progresiva. La falta de un efecto estadísticamente diferente quizá pueda deberse a los excelentes resultados de motilidad obtenidos post-descongelación del semen en todos los tratamientos, ya que normalmente se reporta un rango de entre 30 a 50% para la motilidad post-descongelación (Motlagh et al., 2014; Abdi-Benemar et al., 2015; Masoudi et al., 2017), y en el presente estudio en todos los tratamientos los valores de motilidad fueron superiores a 60 %.

En este estudio, al adicionar una concentración de 200 µM de quercetina, se obtuvo mayor porcentaje en la motilidad y motilidad progresiva (numéricamente) debido a que es un potente antioxidante que actúa en los espermatozoides, inhibiendo los radicales libres, y posee una actividad captadora de ROS más intensa que la vitamina E (Stojanović et al., 2001), evita la capacitación espermática prematura antes de la inseminación artificial y la reacción acrosomal durante su almacenamiento, lo que mejora el tiempo de vida de los espermatozoides (Restrepo et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2016). Acorde con lo anterior, El-Khawagah et al. (2020) reportan que la inclusión de quercetina reduce los niveles de H2O2 y de peroxidación lipídica, que son indicadores de su efecto antioxidante. Asimismo, el efecto positivo en las variables de motilidad puede estar relacionado con la interacción con la Ca2+-ATPasa, enzima clave para la regulación de la motilidad, ya que la quercetina tiene un efecto inhibidor en la bomba Ca2+-ATPasa en la membrana plasmática, y resulta en una elevación de los niveles de Ca2+, que tiene un papel fundamental en la producción de adenosin monofosfato cíclico (cAMP), factores que controlan la motilidad en los espermatozoides (El-Khawagah et al., 2020).

Similar a lo encontrado en el presente estudio, Ardeshirnia et al. (2017) demostraron que al utilizar quercetina en semen de ovino extraído del epidídimo, al momento de la descongelación los espermatozoides mostraron mejor viabilidad al utilizar las concentraciones de 5 y 10 μg/mL en el diluyente del semen, pero la motilidad y motilidad progresiva no se afectó en comparación con el tratamiento control (0 μg/mL). Por otra parte, Ahmed et al. (2019) utilizaron 150 y 200 µM de quercetina en semen criopreservado de búfalo, y en la evaluación post-descongelación, estos tratamientos fueron mejores para motilidad progresiva e integridad de la membrana plasmática en comparación con los demás tratamientos (control, 50 y 100 µM de quercetina).

En el Cuadro 3 se presentan los porcentajes de espermatozoides vivos con acrosoma intacto (VAI), espermatozoides vivos con acrosoma dañado (VAD) y espermatozoides muertos, obtenidos en los diferentes tratamientos. El tratamiento de quercetina mostró una diferencia significativa en comparación con los demás tratamientos en los espermatozoides VAI (P<0.05). Con respecto a los espermatozoides VAD se encontró una diferencia entre los tratamientos vitamina E (100 µM) y quercetina (200 µM), en comparación con los tratamientos control (convencional) y la combinación de vitamina E (100 µM) y quercetina (200 µM) (P<0.05). El tratamiento de quercetina (200 µM) mostró una diferencia significativa, teniendo menos espermatozoides muertos en comparación con los demás tratamientos (P<0.05), lo que indica una mayor viabilidad.

Efecto de la adición de quercetina y vitamina E sobre la vitalidad y daño del acrosoma de los espermatozoides en semen criopreservado de ovino (Media ± desviación estándar)
Tratamiento Vivos Acrosoma Intacto (%) Vivos Acrosoma Dañado (%) Muertos (%)
Control 8.66±4.50 b 48.33±4.50 b 43.00±4.00 bc
Q 22.33±2.51 ª 58.66±1.52 ª 19.00±2.64 a
Vit E 10.66±2.08 b 52.00±5.29 a 38.33±6.08 b
Q + Vit E 11.33±2.08 b 41.33±3.21 b 47.33±1.52 c

,b,c Distintas literales indican diferencia estadísticamente significativa (P <0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.

Estos resultados pueden deberse a que, como se mencionó anteriormente, los antioxidantes tienen un efecto protector, ya que al momento de la criopreservación ocurren deficiencias en la motilidad y viabilidad de los espermatozoides, y esto se debe a el daño que causan los ROS (Karimfar et al., 2015). Aunque los ROS son productos normales del metabolismo celular, cuando existen niveles altos de estos, los ROS son dañinos para los espermatozoides, y se generan tanto en el momento de la criopreservación y en la descongelación, dañando la morfología del espermatozoide (Aitken, 2017), afectando los lípidos y proteínas que protegen a los espermatozoides, lo que puede provocar la muerte de las células (Ardeshirnia et al., 2017).

En este sentido, Ahmed et al. (2019), al utilizar 150 y 200 µM de quercetina en semen criopreservado de búfalo, encontraron que los espermatozoides mostraron menor daño en la integridad de la membrana y daño acrosomal en comparación a los demás tratamientos (control, 50 y 100 µM de quercetina). En el presente estudio, se utilizaron concentraciones similares, 200 µM de quercetina, en el medio de criopreservación para semen de ovino y con este tratamiento se obtuvo una diferencia significativa para la variable espermatozoides VAI, comparado con los demás tratamientos. Lo anterior indica un efecto protector de la quercetina en la membrana acrosomal.

La integridad de la membrana es importante para mantener la viabilidad de los espermatozoides y es precisamente aquí donde ocurren las principales lesiones al momento de la criopreservación-descongelación, ya que la reducción e incremento de la temperatura ocasiona daños ultraestructurales y funcionales. La integridad de la membrana es un requisito fundamental para la viabilidad del espermatozoide y el éxito de la fertilización (Martínez-Pastor et al., 2004; El-Khawagah et al., 2020). El daño parcial o total del acrosoma de los espermatozoides provoca una incapacidad para fertilizar, ya que las muestras seminales con alta proporción de acrosomas alterados o ausentes suelen tener una fertilidad baja. El uso de quercetina en el semen reduce la peroxidación lipídica de los espermatozoides durante la congelación (El-Khawagah et al., 2020) y evita su capacitación prematura antes de la inseminación artificial (Restrepo et al., 2016). Esto se debe a que la presencia y ubicación de las sustituciones de hidroxilo (-OH) y el anillo B de tipo catecol hacen de la quercetina un antioxidante eficaz, ya que posee una actividad captadora de ROS más intensa que la vitamina E (Stojanovic et al., 2001).

Gibb et al. (2013) reportan que la quercetina en una concentración de 150 µM en semen criopreservado de equino, mejoró la motilidad de los espermatozoides al momento de la descongelación, y también incrementó el porcentaje de espermatozoides con el acrosoma intacto, en comparación con los tratamientos con 200 U/mL de catalasa y 0.2 mg/mL de cisteína. Sin embargo, en el estudio realizado por Seifi-Jamadi et al. (2016), al añadir 100 µM de quercetina al medio de criopreservación para semen de equino, obtuvieron un mejor resultado en la motilidad, pero en la vitalidad e integridad de membrana no encontraron un efecto significativo.

Finalmente, en el Cuadro 4 se muestran los resultados de fertilidad (tasa de gestación) en las ovejas inseminadas por laparoscopia, con el semen criopreservado de ovinos adicionado con los diferentes antioxidantes. Contrario a lo esperado, debido a que el tratamiento con quercetina mejoró la protección al acrosoma, no se encontraron diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (P>0.05). Sin embargo, el tratamiento que mostró mayor resultado porcentual (numéricamente) en comparación a los demás tratamientos en la tasa de gestación fue el tratamiento de quercetina 200 µM con 51.92% de fertilidad diagnosticado a los 35 días de gestación.

Efecto de la adición de quercetina y vitamina E en el semen criopreservado de ovino sobre la tasa de gestación en ovejas inseminadas mediante inseminación artificial por laparoscopia
Tratamiento Tasa de gestación (%)
Control 23/50 (46.00%) a
Q 27/52 (51.92%) a
Vit E 17/50 (34.00%) a
Q + Vit E 21/49 (42.82%) a

Distintas literales indican diferencia estadísticamente significativa (P <0.05); Q = 200 µM de quercetina; Vit E = 100 µM de vitamina E.; Q + Vit E = 200 µM de quercetina +100 µM de vitamina E.

Los daños en las células provocan desestabilización e incluso ruptura de las membranas, y pérdida de componentes intracelulares, por ejemplo, enzimas metabólicas y el ATP, con la consiguiente pérdida de la viabilidad espermática. La membrana juega un papel importante en la viabilidad del espermatozoide y del éxito en la fertilización del ovocito, por lo que es importante que se encuentre intacta al momento del descongelamiento (Martínez-Pastor et al., 2004). El daño de la cromatina por lo general comienza en la región peri-acrosomal, las regiones basales del espermatozoide y posteriormente se expande a otras regiones del núcleo durante la criopreservación (Sousa et al., 2016), afecta considerablemente el estado del acrosoma o incluso la vitalidad del espermatozoide, lo que conlleva a una incapacidad para fertilizar. La baja fertilidad reportada en inseminación artificial cuando se utiliza semen criopreservado podría deberse a los daños ocasionados en los espermatozoides durante el proceso de criopreservación-descongelación (Sousa et al., 2016). Por lo anterior, se ha propuesto la adición de antioxidantes en el semen para prevenir los daños producidos en los espermatozoides y mejorar la fertilidad del semen en la inseminación artificial.

La quercetina es un antioxidante que actúa en la membrana, mitocondrias y acrosoma de los espermatozoides protegiéndolos al momento del descenso de la temperatura durante la criopreservación (Seifi-Jamadi et al., 2016). En un estudio realizado por McNiven & Richardson (2006) determinaron que la inclusión de 50 a 300 µM de quercetina en la criopreservación de semen de equino redujo significativamente el porcentaje de espermatozoides que sufrieron capacitación y reacción acrosomal al momento de la descongelación.

Ardeshirnia et al. (2017) reportan incremento de la fertilidad in vitro del semen de ovino, colectado de epidídimo, y criopreservado con la adición de quercetina en concentraciones de 5 y 10 μg/mL, en comparación con los demás tratamientos (0, 15, 20 y 50 μg/mL). Con estas concentraciones de quercetina, aumentó el número de embriones en la etapa de cigoto, mórula y blastocito. En el estudio realizado por Ahmed et al. (2019), al adicionar quercetina en concentraciones de 150 y 200 µM, en el semen criopreservado de búfalo, la fertilidad in vivo fue mayor (61.82 y 65.22%, respectivamente) comparada con el tratamiento control (sin ningún aditivo; 46.90%). En el presente estudio, el incremento numérico en la tasa de fertilidad observado en el tratamiento adicionado con quercetina, quizá pueda relacionarse con el incremento en la vitalidad y la protección del acrosoma, ya que esta concentración de quercetina mostró una diferencia significativa en los espermatozoides VAI en comparación con los demás tratamientos, lo que indica que la fertilidad del semen criopreservado podría incrementarse mediante la adición de antioxidantes como la quercetina en el diluyente, ya que la calidad del semen post- descongelación es uno de los factores que más influyen en la probabilidad de gestación después de la inseminación (Ahmed et al., 2019). Sin embargo, es necesario realizar más estudios donde se evalúen diferentes concentraciones de quercetina y la evaluación de la fertilidad in vivo se realice con un mayor número de ovejas.

 CONCLUSIONES

La adición de 200 µM de quercetina en el semen criopreservado de ovino incrementó el porcentaje de espermatozoides vivos con el acrosoma intacto y vivos con el acrosoma dañado, lo que implica una reducción en el porcentaje de espermatozoides muertos en comparación con los demás tratamientos, lo cual indica que cumplió con sus funciones antioxidantes al proteger a los espermatozoides de los daños provocados por la criopreservación; sin embargo, esto no trajo consigo un incremento en la tasa de gestación. Se recomienda seguir realizando estudios con diferentes concentraciones de quercetina e incrementar los estudios con antioxidantes en pruebas in vivo.

 AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo brindado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología a través del proyecto INFR201501- 251729 y a la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez a través del proyecto UACJ- PIVA 312-17-15.

 LITERATURA CITADA Abdi-Benemar H, Jafaroghli M, Khalili B, Zamiri MJ, Ezazi H, Shadparvar AA. 2015. Effects of DHA supplementation of the extender containing egg yolk and α- tocopherol on the freezability and post-thawing fertility of ram semen. Small Ruminant Research. 130:166-170. ISSN: 0921-4488. https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2015.06.013 Abdi-Benemar H Jafaroghli M Khalili B Zamiri MJ Ezazi H Shadparvar AA. 2015 Effects of DHA supplementation of the extender containing egg yolk and α- tocopherol on the freezability and post-thawing fertility of ram semen Small Ruminant Research 130 166 170 0921-4488 10.1016/j.smallrumres.2015.06.013 Ahmed H, Jahan S, Salman MM, Ullah F. 2019. Stimulating effects of Quercetin (QUE) in tris citric acid extender on post thaw quality and in vivo fertility of buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa. Theriogenology. 134:18-23. 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Clave: e2021-38

 Original Article Evaluation of the quercetin and vitamin E addition to the cryopreservation medium of sheep semen on in vivo fertility ABSTRACT

Cryopreservation induces oxidative stress that has adverse effects on post-thawed semen quality. The objective was to evaluate the effect of adding quercetin to sheep semen cryopreservation medium. Semen was collected from three sheep stallions by artificial vagina, and a commercial diluent was used. Treatments were: control; quercetin 200 µM; vitamin E 100 µM; and the quercetin and vitamin E combination. Vitality, motility, acrosome integrity and fertility were evaluated in vivo. Numerical variables were analyzed with ANOVA and gestation rate with chi-square. In the evaluation of sperm motility characteristics, no significant difference was found between treatments. The treatment with the highest percentage of live spermatozoa with intact acrosome was quercetin 200 µM (22.33±2.51%) compared to the other treatments (P<0.05). In vivo fertility was not statistically significant, but a numerical difference in the gestation percentage was found with the addition of 200 µM quercetin (51.92%) compared to other treatments. In conclusion, the addition of 200 µM quercetin to the ovine semen cryopreservation medium improved the vitality and integrity of the acrosome, but not the in vivo fertility percentage.

 Keywords: antioxidant freezing gestation rate sperm characteristics INTRODUCTION

The objective of cryopreservation is to maintain the viability and functionality of spermatozoa at low temperatures; however, this causes damage and deficiencies in spermatozoa. At the time of cryopreservation, spermatozoa are exposed to physical and chemical impacts that hinder viability, decrease motility, damage the acrosome and decrease their fertility (Mata-Campuzano et al., 2015). This is partly due to the fact that cryopreservation induces oxidative stress, as a result of excessive formation of reactive oxygen species (ROS; El-Khawagah et al., 2020), since membrane polyunsaturated fatty acids are susceptible to ROS damage, and the sperm cytoplasm contains low concentrations of free radical scavenging enzymes (Karimfar et al., 2015).

The addition of antioxidants in semen freezing diluents results in improved post-thaw characteristics, as they protect polyunsaturated fatty acids in spermatozoa, thus preventing oxidative stress damage. Numerous plants have been shown to have an antioxidant effect, as they contain flavonoids with antioxidant capacities such as quercetin, and antioxidant vitamins such as C, E and A (Berkovich et al., 2013). Quercetin is an antioxidant flavonoid commonly present in vegetables, capable of scavenging ROS (El- Khawagah et al., 2020) and has been reported to improve the quality of post-thawed semen (Silva et al., 2012; Gibb et al., 2013). Vitamin E is a lipophilic antioxidant that protects unsaturated fatty acids against peroxidation as it is a potent scavenger of peroxyl radicals and a major inhibitor of the lipo-peroxidation chain reaction in animals (Allai et al., 2018), and it is commonly used as an antioxidant in semen cryopreservation (Abdi-Benemar et al., 2015; Benhenia et al., 2016).

Compared to other insemination techniques, artificial insemination by laparoscopy is used as an alternative for the use of cryopreserved semen, as the damage that occurs to spermatozoa at the time of cryopreservation limits post-insemination fertility with vaginal or cervical techniques (Allai et al., 2018). However, there is no report of in vivo fertility evaluation following the addition of antioxidants such as quercetin and vitamin E in sheep cryopreserved semen. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of quercetin addition in sheep semen cryopreservation medium on sperm characteristics and in vivo fertility.

 MATERIAL AND METHODS Study area and animals

The study was conducted at the Animal Research and Reproduction Laboratory of the Autonomous University of Ciudad Juarez (UACJ). Artificial insemination was performed on a farm located in Juárez City at coordinates 31°43'12.9" N and 106°27'39.0" W, in the north of Chihuahua State. Semen processing and artificial insemination were performed during the reproductive season (July to February).

Semen was collected from three Katahdin stallions, approximately three years old, with a body condition of 4 (scale of 1-5). To evaluate the fertility of the cryopreserved semen, 201 hair breed females (Katahdin, Pelibuey, Blackbelly), aged between 2 and 4 years and with a body condition between 2 and 4 on the 1-5 scale, were inseminated. Animals were fed alfalfa, commercial concentrate and water ad libitum. All procedures in the present study were performed according to Mexican animal care and health techniques (NOM- 051-ZOO-1995) and with the approval of the Institutional Ethics and Bioethics Committee of the UACJ (CIEB-2019-1-093).

 Semen collection and pre-cryopreservation evaluation

Each stallion was worked individually for semen collection, using the artificial vagina technique. Once the samples were collected, they were kept in a water bath at 37.5 °C (Presicion Water 282, Thermo Scientific, USA) while the three samples were collected and evaluated. Semen collection was performed twice a week for six weeks. Twelve ejaculates per ewe were evaluated, for a total of 36 ejaculates evaluated.

Pre-cryopreservation evaluation was performed by taking 10 µL of each sample using a pipette (Magnetic-Assist Pipette, Rainin, USA), which was deposited in a 20 µm standard counting chamber (Leja Chamber, Leja Products, The Netherlands), to be evaluated by computer-assisted semen analysis (CASA; AndroVision, Minitube, Germany) with an upright microscope (AxioScope.A1, Zeiss, Germany). Progressive motility (%) and sperm concentration (cells/mL) were evaluated. The following were established as minimum levels required for freezing: ejaculate volume ≥ 0.5 mL, progressive motility ≥ 80%, and a concentration of 3x109 spermatozoa/mL (Câmara et al., 2011).

 Dilution and processing of semen.

Ejaculates were processed individually, as they were used for artificial insemination. A dilution protocol was performed with a commercial diluent (Two Step; Continental Plastic Corp., USA) with 6% glycerol (v/v) and 10% egg yolk (v/v). The dilution was worked at a temperature of 37 °C. The ejaculate obtained was diluted to a concentration of 120x106 motile spermatozoa per mL. Once diluted, the semen was packed in 0.25 mL straws, with a concentration of 30x106 motile spermatozoa per straw, and stored at 5 °C for two hours.

Once the straws were refrigerated and equilibrated at 5 °C, they were placed in an ice chest 5 cm from the nitrogen mirror for 10 minutes, then dropped into nitrogen and allowed to stand for 5 minutes. The straws were then placed in a cryogenic thermos for preservation; they remained there until the time of analysis and later for use in artificial insemination by laparoscopy.

 Treatments

The diluted samples were fractionated into four similar portions and four treatments were performed: control treatment was performed in the conventional manner; quercetin (Q) treatment, 200 µM quercetin (Q4951, Sigma Aldrich, USA) was added; vitamin E (VE) treatment, 100 µM vitamin E (47786, Sigma Aldrich, USA) was added; and Q + VE treatment, a combination of quercetin (200 µM) and vitamin E (100 µM) was added.

 Thawing of semen samples

Thawing of the semen was carried out by placing each straw in a water bath (Presicion Water 282, Thermo Scientific, USA) at 37.5 °C for 40 seconds. To evaluate semen characteristics and acrosome integrity, a total of six straws per treatment per sheep (24 straws) were randomly selected and thawed.

 Evaluation of post-thawing seminal characteristics

To evaluate seminal characteristics, 10 μL of semen were placed in the standard counting chamber to evaluate motility (%), progressive motility (%) and fast motility (%), using the CASA system. Table 1 shows the configuration of the CASA system used to evaluate sheep semen.

Configuration of the CASA* system used to evaluate sheep semen
Variable Configuration
Horizontal/vertical resolution 1024 pixels x 1024 pixels
Horizontal/vertical pixel size 5.5 µm x 5.5 µm
Frames per second Up to 101 frames per second
Area 10-100
Tail detection 5 µm
Camera depth 20 µm
Pixel ratio 0.54 µm
Reference volume
Width 555.12 µm
Height 555.12 µm
In-motile spermatozoa ALC < 20.00 µm s-1 and FBC < 10.00 µm s-1
Motility
Local motility VCL < 20.00 µm s-1 and VLR < 10.00 µm s-1
Progressive motility
Circular motility Radio > 10.00 µm s-1 a < 80.00 µm s-1 and rotation > 0.70 µm s- 1
Slow motility VCL < 80.00 µm s-1
Fast motility VCL < 80.00 µm s-1

Androvision, Minitube, Germany.

ALC, head lateral displacement amplitude; FBC, tail beat frequency; VCL, curvilinear velocity; VLR, straight-line velocity.

Evaluation of acrosomal membrane damage.

Ten μL of the semen sample was taken and deposited in a 1 mL microtube (Eppendorf, Germany) and mixed with 10 μL of trypan blue reagent (T8154, Sigma Chemical Co., USA), and 10 μL of the mixture was placed on a slide to make a smear. Subsequently, the smear was fixed with ethanol for two minutes, rinsed with distilled water and allowed to dry. Once fixation was completed, the slides were placed in a Giemsa-stained container (48900, Sigma Chemical Co., USA) where they remained for 18-20 hours. The slide was then rinsed to remove excess dye with distilled water and allowed to dry. Evaluation of sperm cell staining was performed by light microscopy at 100X (PrimoStar, Carl Zeiss, Germany). To obtain a representative mean of each straw, three smears per straw were performed making a count of 100 spermatozoa per smear. Spermatozoa were classified into three types: live spermatozoa with intact acrosome (stained purple in the acrosomal region), live spermatozoa with damaged acrosome (no purple accumulation in the acrosomal region) and dead spermatozoa (cytoplasm stained blue).

 Artificial insemination by laparoscopy and pregnancy diagnosis

Ewes were synchronized in estrus using intravaginal sponges (Cronogest CR®, Intervet International, The Netherlands) impregnated with 40 mg fluorogestone acetate for 12 days. Upon sponge removal, 200 IU of equine chorionic gonadotropin (Novormon® 5000, Virbac, Argentina) was applied to each ewe. Estrus detection was performed by introducing a sire attached with a rope (without allowing the female to mount) to a pen with the previously synchronized females, 16 h prior to insemination (Alhamada et al., 2017). Females in estrus were inseminated 55 h after sponge removal by laparoscopy technique. Prior to insemination, straws were thawed in a thawing thermos (Cito Products Incorporated, USA) at 37.5 °C for 40 sec. Semen was applied intrauterine with the aid of a laparoscope (250 W Halogen, Wolf, USA) and an aspic (Aspic, IVM, France). The insemination dose (0.25 mL) was equally distributed in both uterine horns. A total of 201 ewes were inseminated, distributed by treatment as follows: control, 50 ewes; quercetin (Q), 52 ewes; vitamin E (VE), 50 ewes; and Q + VE treatment, 49 ewes.

Gestation diagnosis was performed by ultrasound with a 6.5 MHz linear transducer (Kaixin, Xuzhou Kaixin Electronic Instrument CO., China), rectally, 35 days after insemination, regardless of the treatment performed on the extender used for semen cryopreservation. Fertility (gestation rate) was determined by obtaining the percentage of females that became pregnant out of the total number of females inseminated per treatment.

 Statistical analysis

All statistical analyses were performed with the SAS 9.0 program (Inst. Cary, NC, United States of America). Percentage data were transformed into arcsine before statistical analysis. Analysis of variance was performed using the General Linear Model procedure for the numerical variables: motility, progressive motility, rapid motility, and acrosome integrity. Comparison of means between treatments was performed using Duncan's test. The chi-square test was used for gestation rate. Differences were considered statistically significant at P < 0.05.

 RESULTS AND DISCUSSION

Effect results of different treatments on the sperm motility characteristics evaluated are shown in Table 2. In the study, no treatment presented a statistically significant difference (P > 0.05) in the motility, progressive motility and fast motility variables. Nevertheless, numerically, the treatment that presented the highest percentage of motility (71.57%) and progressive motility (68.13%) was the quercetin treatment compared to the other treatments. However, in the fast motility variable, the treatment with the highest percentage (numerically) was the vitamin E treatment with 31.48 %.

Effect of quercetin and vitamin E addition on sperm motility characteristics of cryopreserved sheep semen (Mean ± standard deviation)
Treatment Motility (%) Progressive motility (%) Fast motility (%)
Control 67.20±20.82 a 63.52±21.31 a 26.65±16.68 a
Q 71.57±6.40 a 68.13±6.57 a 27.31±8.22 a
Vit E 69.36±11.41 a 65.92±12.62 a 31.48±13.15 a
Q + Vit E 60.07±13.16 a 53.95±14.50 a 16.93±8.72 a

Different literals between rows indicate statistically significant difference (P < 0.05); Q = 200 µM quercetin; Vit E = 100 µ M Vit E.; Q

+ Vit E = 200 µM quercetin +100 µM Vit E.

As mentioned, cryopreservation induces oxidative stress as a result of the formation of excess ROS, which affects the structure of the spermatozoa, and affects sperm characteristics, causing damage to DNA, lipids and proteins that protect sperm structure, as it alters enzyme systems and cell signaling pathways, which can lead to cell death. Sperm damage caused by ROS occurs during cryopreservation and thawing, and even during storage in liquid nitrogen. It is important to mention that sperm normally generate small amounts of ROS that are important for different sperm physiological processes such as capacitation, hyperactivation and oocyte fertilization (Mata-Campuzano et al., 2015; Aitken, 2017); however, once these physiological levels exceed oxidative control mechanisms, oxidative stress is caused (El-Khawagah et al., 2020). Therefore, to reduce the damage caused by the negative effects of ROS, several authors have proposed the supplementation of antioxidants to freezing media, such as vitamin E and quercetin. For example, Sarlós et al. (2002), Silva et al. (2012), and Abdi-Benemar et al. (2015) have evaluated the addition of vitamin E to sheep semen cryopreservation media, and report favorable effects on acrosomal integrity, vitality, and motility. However, in the present study, no favorable effect of vitamin E addition as an antioxidant on the motility variables evaluated was found. These contradictory effects of the addition of vitamin E may be due to different components of the diluents, since Sarlós et al. (2002) mention that the effect of vitamin E varies in response to the sugar and buffer used in the diluents; this could also explain why in the treatment where vitamin E and quercetin were combined there was also no favorable effect on the variables evaluated. In the present study, the diluent used contains fructose as an energy source and tris aminomethane (TRIS) as a buffer, and Sarlós et al. (2002) indicate that the addition of vitamin E is more effective when sucrose- based diluents contain glucose and TRIS.

Similarly, it has been reported that the addition of quercetin in semen cryopreservation media of different species produces favorable effects on acrosomal motility and integrity (Gibb et al., 2013; Seifi-Jamadi et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2017; Ahmed et al., 2019; El-Khawagah et al., 2020), although some authors have reported no positive effects of quercetin addition (Silva et al., 2012; Banday et al., 2017) or even report negative effects (Restrepo et al., 2016). In the present study, although the addition of quercetin did not show a statistical difference in the motility variables evaluated, it showed a higher percentage (numerically) compared to the other treatments in the motility and progressive motility variables. The lack of a statistically different effect may perhaps be due to the excellent motility results obtained post-thawing of semen in all treatments, as normally a range of between 30 to 50% is reported for post-thawing motility (Motlagh et al., 2014; Abdi-Benemar et al., 2015; Masoudi et al., 2017), and in the present study in all treatments motility values were higher than 60 %.

In this study, by adding a concentration of 200 µM quercetin, higher percentage was obtained in motility and progressive motility (numerically) because it is a potent antioxidant that acts on spermatozoa, inhibiting free radicals, and has a more intense ROS scavenging activity than vitamin E (Stojanović et al., 2001), prevents premature sperm capacitation before artificial insemination and acrosomal reaction during storage, which improves sperm lifespan (Restrepo et al., 2016; Seifi-Jamadi et al., 2016). In line with the above, El-Khawagah et al. (2020) report that the inclusion of quercetin reduces H2O2 and lipid peroxidation levels, which are indicators of its antioxidant effect. Also, the positive effect on motility variables may be related to the interaction with Ca2+-ATPase, a key enzyme for motility regulation, since quercetin has an inhibitory effect on the Ca2+-ATPase pump in the plasma membrane, and results in an elevation of Ca2+ levels, which has a fundamental role in the production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), factors that control motility in spermatozoa (El-Khawagah et al., 2020).

Similar to what was found in the present study, Ardeshirnia et al. (2017) demonstrated that by using quercetin in sheep semen extracted from the epididymis, upon thawing spermatozoa showed better viability when using the concentrations of 5 and 10 μg/mL in the semen extender, but progressive motility and motility were not affected compared to the control treatment (0 μg/mL). On the other hand, Ahmed et al. (2019) used 150 and 200 µM quercetin in cryopreserved buffalo semen, and in post-thaw evaluation, these treatments were better for progressive motility and plasma membrane integrity compared to the other treatments (control, 50 and 100 µM quercetin).

Table 3 shows the percentages of live sperm with intact acrosome (LIA), live sperm with damaged acrosome (LDA) and dead sperm, obtained in the different treatments. The quercetin treatment showed a significant difference compared to the other treatments in LIA spermatozoa (P<0.05). With respect to LDA spermatozoa, a difference was found between the vitamin E (100 µM) and quercetin (200 µM) treatments, compared to the control (conventional) treatments and the combination of vitamin E (100 µM) and quercetin (200 µM) (P<0.05). The quercetin treatment (200 µM) showed a significant difference, having fewer dead spermatozoa compared to the other treatments (P<0.05), indicating higher viability.

Effect of quercetin and vitamin E addition on sperm vitality and acrosome damage in cryopreserved sheep semen (Mean ± standard deviation)
Treatment Live Intact Acrosome (%) Live Damaged Acrosome (%) Dead (%)
Control 8.66±4.50 b 48.33±4.50 b 43.00±4.00 bc
Q 22.33±2.51 ª 58.66±1.52 ª 19.00±2.64 a
Vit E 10.66±2.08 b 52.00±5.29 a 38.33±6.08 b
Q + Vit E 11.33±2.08 b 41.33±3.21 b 47.33±1.52 c

,b,c Different literals indicate statistically significant difference (P <0.05); Q = 200 µM quercetin; Vit E = 100 µM vitamin E.; Q + Vit E = 200 µM quercetin + 100 µM vitamin E.; Q + Vit E = 200 µM quercetin + 100 µM vitamin E.; Q + Vit E = 200 µM quercetin + 100 µM quercetin + 100 µM vitamin E.

These results may be due to the fact that, as mentioned above, antioxidants have a protective effect, since deficiencies in sperm motility and viability occur at the time of cryopreservation, and this is due to the damage caused by ROS (Karimfar et al., 2015). Although ROS are normal products of cell metabolism, when there are high levels of these, ROS are harmful to spermatozoa, and are generated both at the time of cryopreservation and thawing, damaging sperm morphology (Aitken, 2017), affecting lipids and proteins that protect spermatozoa, which can lead to cell death (Ardeshirnia et al., 2017).

In this regard, , Ahmed et al. (2019), using 150 and 200 µM quercetin in cryopreserved buffalo semen, found that spermatozoa showed less damage in membrane integrity and acrosomal damage compared to the other treatments (control, 50 and 100 µM quercetin). In the present study, similar concentrations, 200 µM quercetin, were used in the cryopreservation medium for ovine semen and with this treatment a significant difference was obtained for the LIA spermatozoa variable, compared to the other treatments. This indicates a protective effect of quercetin on the acrosomal membrane.

Membrane integrity is important for maintaining sperm viability and it is precisely here where the main lesions occur at the time of cryopreservation-thawing, since the reduction and increase in temperature causes ultrastructural and functional damage. Membrane integrity is a fundamental requirement for sperm viability and successful fertilization (Martínez-Pastor et al., 2004; El-Khawagah et al., 2020). Partial or total damage to the sperm acrosome results in an inability to fertilize, as seminal samples with a high proportion of altered or absent acrosomes tend to have low fertility. The use of quercetin in semen reduces lipid peroxidation of spermatozoa during freezing (El-Khawagah et al., 2020) and prevents their premature capacitation prior to artificial insemination (Restrepo et al., 2016). This is because the presence and location of hydroxyl substitutions (-OH) and the catechol-type B-ring make quercetin an effective antioxidant, as it possesses a more intense ROS scavenging activity than vitamin E (Stojanovic et al., 2001).

Gibb et al. (2013) report that quercetin at a concentration of 150 µM in cryopreserved equine semen improved sperm motility upon thawing, and also increased the percentage of sperm with intact acrosome compared to treatments with 200 U/mL catalase and 0.2 mg/mL cysteine. However, in the study by Seifi-Jamadi et al. (2016), by adding 100 µM quercetin to the cryopreservation medium for equine semen, they obtained a better result in motility, but in vitality and membrane integrity they did not find a significant effect.

Finally, Table 4 shows the fertility results (gestation rate) in the ewes inseminated by laparoscopy with the cryopreserved semen of sheep added with the different antioxidants. Contrary to expectations, because quercetin treatment improved acrosome protection, no significant statistical differences were found between treatments (P>0.05). However, the treatment that showed the highest percentage result (numerically) compared to the other treatments in the gestation rate was the quercetin 200 µM treatment with 51.92% fertility diagnosed at 35 days of gestation.

Addition effect of quercetin and vitamin E in cryopreserved sheep semen on gestation rate in ewes inseminated by laparoscopic artificial insemination
Treatment Gestation rate (%)
Control 23/50 (46.00%) a
Q 27/52 (51.92%) a
Vit E 17/50 (34.00%) a
Q + Vit E 21/49 (42.82%) a

Different literals indicate statistically significant difference (P <0.05); Q = 200 µM quercetin; Vit E = 100 µM vitamin E.; Q + Vit E = 200 µM quercetin +100 µM vitamin E.

Damage to the cells causes destabilization and even rupture of the membranes, and loss of intracellular components, for example, metabolic enzymes and ATP, with the consequent loss of sperm viability. The membrane plays an important role in sperm viability and successful fertilization of the oocyte, so it is important that it is intact at the time of thawing (Martínez-Pastor et al., 2004). Chromatin damage usually starts in the peri-acrosomal region, the basal regions of the sperm and subsequently expands to other regions of the nucleus during cryopreservation (Sousa et al., 2016), significantly affects the acrosome status or even the sperm vitality, leading to an inability to fertilize. The low fertility reported in artificial insemination when using cryopreserved semen could be due to the damage caused to the spermatozoa during the cryopreservation-thawing process (Sousa et al., 2016). Therefore, the addition of antioxidants in semen has been proposed to prevent damage to spermatozoa and improve semen fertility in artificial insemination.

Quercetin is an antioxidant that acts on the membrane, mitochondria and acrosome of spermatozoa protecting them upon temperature drop during cryopreservation (Seifi- Jamadi et al., 2016). In a study by McNiven & Richardson (2006) determined that the inclusion of 50 to 300 µM quercetin in equine semen cryopreservation significantly reduced the percentage of sperm that underwent capacitation and acrosomal reaction upon thawing.

Ardeshirnia et al. (2017) report increased in vitro fertility of ovine semen, collected from epididymis, and cryopreserved with the addition of quercetin at concentrations of 5 and 10 μg/mL, compared to the other treatments (0, 15, 20 and 50 μg/mL). With these quercetin concentrations, the number of embryos at the zygote, morula and blastocyst stage increased. In the study by Ahmed et al. (2019), by adding quercetin at concentrations of 150 and 200 µM, in cryopreserved buffalo semen, in vivo fertility was higher (61.82 and 65.22%, respectively) compared to the control treatment (without any additive; 46.90%). In the present study, the numerical increase in fertility rate observed in the quercetin-added treatment may perhaps be related to the increased vitality and protection of the acrosome, as this concentration of quercetin showed a significant difference in LIA spermatozoa compared to the other treatments, indicating that the fertility of cryopreserved semen could be increased by the addition of antioxidants such as quercetin in the extender, since post-thaw semen quality is one of the most important factors influencing the probability of gestation after insemination (Ahmed et al., 2019). However, further studies are needed where different quercetin concentrations are evaluated and in vivo fertility evaluation is performed with a larger number of ewes.

 CONCLUSIONS

The addition of 200 µM quercetin in cryopreserved ovine semen increased the percentage of live spermatozoa with intact acrosome and live sperm with damaged acrosome, which implies a reduction in the percentage of dead spermatozoa compared to the other treatments, indicating that it fulfilled its antioxidant functions by protecting the spermatozoa from damage caused by cryopreservation; however, this did not result in an increase in the gestation rate. It is recommended to continue studies with different concentrations of quercetin and to increase the studies with antioxidants in in vivo tests.

 ACKNOWLEDGMENTS

We are grateful for the support provided by the National Science and Technology Council through project INFR201501- 251729 and to the Autonomous University of Ciudad Juarez through project UACJ- PIVA 312-17-15.

Code: e2021-38