av Abanico veterinario Abanico vet 2007-428X 2448-6132 Sergio Martínez González 10.21929/abavet2021.31 00404 Nota Corta Desarrollo y validación de dos inmunoensayos para la detección de Brucella canis en perros 0000-0003-0686-6932 Palacios-Rodríguez Victor 1 0000-0003-1671-6401 Benítez-Guzmán Alejandro 1 0000-0002-4103-3242 Morales-Aguilar Aldo 1 0000-0003-0118-2494 Suárez-Güemes Francisco 1 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito exterior S/N, Ciudad Universitaria, Coyoacán, Ciudad de México, México. C. P. 04510. Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Nacional Autónoma de México Ciudad de México Mexico Autor para correspondencia: Beatriz Arellano-Reynoso. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, Circuito exterior S/N, Ciudad Universitaria, Coyoacán, Ciudad de México, México. C. P. 04510. mvzpalaciosr@gmail.com, arerey@yahoo.com, ale.benitezg@gmail.com, aldomorales.ag@gmail.com, fsg@unam.mx. 31 10 2021 Jan-Dec 2021 11 e404 12 11 2020 08 08 2021 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN:

La brucelosis canina es causa de falla reproductiva y la detección temprana en los perros infectados sigue siendo un desafío. El objetivo del presente estudio fue probar dos antígenos para ser utilizados en dos diferentes inmunoensayos, para la detección de infección por Brucella canis en perros: uno a partir de antígeno crudo sonicado de Brucella canis RM6/66 (AC-iELISA) y otro utilizando la proteína inmunodominante GroEL (GroEL-iELISA). Se determinó el punto de corte usando sueros de perros infectados; posteriormente, se midió la reproducibilidad y se obtuvo un coeficiente de variación (CV) debajo de 15 % para negativos y positivos con el AC-iELISA, mientras que, para el GroEL-iELISA fueron superiores a 15 %. En la prueba de robustez, hubo diferencias significativas para el GroEL-iELISA, más no para el AC-iELISA. La prueba de selectividad mostró reacción cruzada con Leptospira interrogans en el AC-iELISA, y con L. interrogans y Salmonella spp. en el GroEL-iELISA. A partir de las pruebas de la estabilidad de la muestra se demostró que éstas deben almacenarse a temperatura ambiente no más de 2 horas, a 4 ºC no más de 24 horas y pueden mantenerse a -20 ºC hasta 30 días. Finalmente, se calcularon la sensibilidad y especificidad, resultando 100 % ambas para el AC-iELISA; una sensibilidad de 44 % y especificidad de 67 % para el GroEL-iELISA. En conclusión, el AC-iELISA demostró ser mejor en detectar a Brucella canis que el GroEL-iELISA.

 Palabras clave: Brucella canis Brucelosis canina GroEL ELISA INTRODUCCIÓN

La brucelosis es la zoonosis bacteriana más extendida en todo el mundo (Corbel, 2006). Sin embargo, sigue siendo una de las enfermedades a las que menos se presta atención como posible causa de afecciones crónico-degenerativas (Hull y Schumaker, 2018). La Brucelosis canina fue descrita por Leeland Carmichael en 1966, tras aislar el agente Brucella canis de Beagles con problemas reproductivos (Cosford, 2018). Es la causa más común de fallo reproductivo en perros, (Hensel et al., 2018) afectando principalmente a perros domésticos y de refugio (Hubbard et al., 2018) en los que la fiebre se acompaña de epididimitis, prostatitis y fallo reproductivo, además de manifestaciones no reproductivas como linfadenitis, uveítis, endoftalmitis, dermatitis piogranulomatosa, meningoencefalitis y discoespondilitis (Cosford, 2018; Wanke, 2004). La detección se basa actualmente en el aislamiento del agente mediante cultivo bacteriano y seroaglutinación (Cosford, 2018). Sin embargo, el diagnóstico serológico es problemático en la identificación de casos crónicos, y el cultivo presenta un riesgo para el personal de laboratorio (Hull y Schumaker, 2018). Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos métodos para la detección de este microorganismo, y los métodos serológicos son ideales dada su facilidad de uso y fiabilidad demostrada (Cosford, 2018; Hull y Schumaker, 2018). Sin embargo, estos métodos requieren un buen control de calidad, por lo que deben ser validados antes de ser utilizados en el campo (Andreasson et al., 2015).

El objetivo de este estudio es establecer un método serológico (I - ELISA) para la detección de anticuerpos de Brucella canis en perros, utilizando como antígeno de captura la proteína chaperona GroEL de 60 kDa, y un antígeno crudo sonicado (CA). Finalmente, comparar el rendimiento de ambos inmunoensayos y determinar las condiciones para su máxima utilidad.

 MATERIAL Y MÉTODOS Animales y sueros

Para este estudio se utilizaron sueros de 10 perros beagle infectados experimentalmente con B. canis, obtenidos en un trabajo previo, amablemente donados por Efrén Díaz (CENID SAI; INIFAP SAGARPA, México) (Tuxpan Galván, 2015), confirmados por la prueba de aglutinación rápida en portaobjetos (RSAT) y el aislamiento bacteriano de las muestras de sangre. Brevemente, los animales fueron inoculados por instilación en la conjuntiva con 5 x 106 UFC/ml de una cepa de campo de B. canis, se tomaron muestras de sangre a diferentes días post infección y se cultivaron en medio Ruiz-Castañeda. La identificación de Brucella canis se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina según la metodología descrita por Alton (1988).

Se utilizaron sueros de 10 perros clínicamente sanos, cuya última vacunación contra cualquier agente fue al menos seis meses antes de la toma de muestras y que dieron un resultado negativo en el RSAT (Carmichael y Joubert, 1987). Para las pruebas de selectividad, se utilizaron tres sueros de perros con infecciones de Leptospira interrogans confirmadas por la prueba de aglutinación microscópica, dos sueros de perros recientemente vacunados contra L. interrogans, Adenovirus canino tipo 1 y 2, y Moquillo canino, y suero de un perro positivo para infección gastrointestinal con Salmonella spp., confirmado por cultivo. Todos estos sueros provenían del stock de sueros del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Autónoma de México.

 Antígenos

El antígeno crudo (AC) se obtuvo mediante la sonicación de la cepa RM6/66 de B. canis utilizando un método previamente descrito (de Oliveira et al., 2011); brevemente, se tomaron 2 g de biomasa de B. canis inactivada por calor (75 °C durante 1 h) y se colocaron en 10 mL de una solución que contenía 10 mM de HEPES pH 7.5, y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Las bacterias fueron así sonicadas (Vibra Cell VCX 130 - Sonics) (4 pulsos de 1 min a 15 Hz) en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma-Aldrich, Saint Luis, Mo). Para corroborar la disrupción celular, se realizó una tinción de Gram. Una vez sonicada la biomasa bacteriana, se centrifugó a 700 x g durante 30 min a 4 °C para obtener la fracción soluble (sobrenadante).

La proteína purificada (GroEL) se obtuvo a partir de la fracción soluble mediante cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) utilizando una columna de intercambio aniónico (HiTrap Capto Q; GE Healthcare) con cromatografía líquida (AKTA Pure; GE Healthcare). La columna se tamponó con 5 mL de una solución de Tris-HCl (5 mM) y EDTA (10 mM), luego se introdujo la muestra con un flujo de 1 mL/min y se lavó con la solución descrita anteriormente. El tampón de elución (1 M NaCl) se incluyó en un gradiente lineal de 0 % a 100 % en nueve volúmenes de 1 mL cada uno. Cada fracción se obtuvo en un volumen de 0.5 mL y se resolvió mediante SDS-PAGE al 12 % por duplicado y se tiñó con azul de Coomassie o se transfirió a una membrana de PVDF para la inmunotransferencia, utilizando sueros de perros infectados; además se utilizó anti IgG de perro como anticuerpo secundario (1:10000) y ECL West femto como sustrato (ThermoFisher, Carlsbad, California). Posteriormente, las fracciones se concentraron 3 veces en un Amicon ultra 50kDa (Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y se resuspendieron en PBS y se seleccionaron dos fracciones que contenían dos bandas cada una (entre 55 kDa y 70 kDa), para resolverlas en un gel mediante enfoque isoeléctrico (EIE) (un total de 20 µg de proteína) seguido de una electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional y se verificó la antigenicidad de cada mancha mediante Western blot con la ayuda de sueros de perros infectados por B. canis. Se identificaron tres manchas como GroEL mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas, tal y como se describe en un trabajo anterior, con una cobertura del 29, 51 y 21 % para cada mancha (Morales Aguilar, 2016) (Material Suplementario).

 Protocolo iELISA utilizando el antígeno crudo sonicado

El ELISA con antígeno crudo (AC-iELISA) se realizó en placas de poliestireno de 96 pocillos de unión media (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich), añadiendo 240 ng de antígeno diluido en 100 µL por pocillo en solución tampón fosfato (PSB); se homogeneizó a 100 rpm durante 5 min y se incubó a 37 °C durante 17 +/- 1 h. Se lavó tres veces con 200 µl de una solución de PBS + Tween 20 (Sigma-Aldrich) al 0.1% (PBS- Tween 20). Se añadió una solución de albúmina de suero bovino (Bovine serum albumin; Sigma-Aldrich) diluida al 1 % en PBS (100 µl por pocillo), se incubó durante 60 minutos a 37 °C y se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Se añadió el suero diluido en PBS 1:250 en 100 µL, después se incubó a 37 °C durante 60 min, tras lo cual se lavó tres veces con 200 µL de Tween 20 al 0.1 %. Se añadió una solución de 100 µl del anticuerpo secundario anti-IgG canina de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (anticuerpo secundario anti-IgG canina de conejo (H+L), HRP; Invitrogen), diluido 1:2000 en PBS (solución ABTS; Roche), se incubó a 37 °C durante 60 min y se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Por último, se añadieron 100 µL de ABTS (Sigma- Aldrich) a cada pozo en la oscuridad y se incubaron con el pozo cubierto con papel de aluminio, a temperatura ambiente en agitación orbital a 100 rpm durante 25 min. Las placas se leyeron con un lector de ELISA (Biotek Instruments) a una longitud de onda de 405 nm utilizando el programa Gen5 (https://www.biotek.es/es/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/).

 iELISA protocol using GroEL

Para la técnica que utiliza GroEL como antígeno de captura (GroEL - iELISA), se sensibilizó una placa de 96 pocillos (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich) utilizando 10 ng de proteína GroEL purificada diluida en suficiente solución tampón de carbonato (0.05 M, pH 9.6) para alcanzar un volumen de 100 µl por pocillo. La placa se colocó en agitación orbital a 100 rpm durante 5 minutos, se cubrió con parafilm (Parafilm M; Merck) y se incubó a 4 °C durante 17 ± 1 h, después se lavó tres veces con 200 µl de Tween 20 al 0.1 %. Se añadieron 100 µl de suero diluido 1:500 en PBS con albúmina de suero bovino a 1 g/L (0.1 M, pH 7), se cubrió con parafilm, se incubó durante 1 h a 37 °C y se lavó tres veces con Tween 20 al 0.1 %. Se añadieron 100 µl por pocillo de una dilución 1:2000 del anticuerpo anti-IgG canina de cabra con peroxidasa (anticuerpo secundario anti-IgG canina de cabra (H+L), HRP; Invitrogen) diluido en PBS (0.1 M, pH 7), se cubrió con parafilm y se incubó durante 1 h a 37 °C, después se lavó tres veces con Tween 20 al 0.1 %. Por último, se añadieron 100 µL de ABTS a cada pocillo en la oscuridad, cubriendo la placa con papel de aluminio y colocándola en agitación orbital a 100 rpm durante 25 min. La lectura se realizó en un lector de ELISA (Bio-Tek/ELX808; Biotek) a una longitud de onda de 405 nm utilizando el software Gen5.

 Protocolo de validación interno

El punto de corte se determinó utilizando un método previamente descrito (Frey et al., 1998) y se calculó utilizando la siguiente ecuación:

PUNTO DE CORTE=X-+SD t1+(1/n)

Donde X- es la media de los resultados obtenidos de una serie de controles negativos, DS es la desviación estándar de esa serie de resultados, t es el percentil (1 - α) de una distribución t de Student de una cola con (n - 1) grados de libertad, y n es el número de controles analizados. Los resultados se consideran positivos para la infección por B. canis si están por encima del resultado de este cálculo. A continuación, se evaluó la precisión mediante el cálculo de la precisión intermedia y la repetibilidad utilizando el material complementario de una guía, (Andreasson et al., 2015) donde el Coeficiente de Variación (% CV) se calcula a partir de una serie de mediciones independientes en diferentes días (Precisión Intermedia), así como una serie de mediciones simultáneas (Repetibilidad). Además, se calcularon la media y la desviación estándar de estos parámetros, utilizando un control positivo y un control negativo. Las repeticiones se realizaron en cinco días diferentes, cinco veces cada uno. Se evaluó la robustez de las pruebas para los sueros positivos y negativos, variando en +/- 5 °C la temperatura de incubación de los sueros de referencia, utilizando 37 ºC como temperatura de referencia. Del mismo modo, se varió el tiempo de incubación en +/- 5 min en comparación con el estándar; los resultados se compararon mediante un ANOVA y las diferencias significativas se determinaron mediante la prueba de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey (Andreasson et al., 2015). La selectividad se evaluó utilizando sueros de perros positivos a enfermedades distintas de la Brucelosis canina. Para evaluar la estabilidad de la muestra, se prepararon 19 alícuotas de un control positivo y un control negativo y se sometieron a un proceso de congelación-descongelación para su comparación utilizando el siguiente protocolo: (Andreasson et al., 2015).

Las alícuotas 1 a 6 se descongelaron a temperatura ambiente durante 2 h y luego se volvieron a congelar durante 12 h.

Las alícuotas 2 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.

Los números 3 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.

Los números 4 a 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.

Los números 5 y 6 se descongelaron durante 2 h y se volvieron a congelar durante 12 h.

La alícuota 6 se descongeló durante 2 h. y se volvió a congelar durante 12 h.

Las muestras 7 a 12 se mantuvieron a temperatura ambiente desde el inicio de la evaluación; una alícuota se trasladó al congelador después de 1 h, una segunda alícuota después de 2 h, una tercera alícuota después de 4 h, una cuarta alícuota después de 24 h, una quinta alícuota después de 72 h y la sexta alícuota después de 168 h.

Las alícuotas 13 a 18 se mantuvieron a 4 °C desde el inicio de la evaluación y se trasladaron al congelador siguiendo el mismo proceso descrito en el punto 7.

La alícuota 19 se mantuvo a -20 °C y se analizó un mes después.

Por último, se comprobó la sensibilidad y la especificidad utilizando 10 sueros negativos y 10 positivos, ajustando los resultados según la fórmula descrita anteriormente para obtener el intervalo de confianza del 95 % (IC95%) (DasGupta et al., 2001; Jacobson, 1998), mediante el siguiente cálculo:

A = 2r + 1.962

B=1.961.962+4r(1-p)

C = 2(n + 1.962)

Construyendo el intervalo de confianza como (A-B)/C, (A+B)/C.

 RESULTADOS I-ELISA utilizando antígeno crudo sonicado

El punto de corte en 0.98 DO se calculó utilizando 10 controles negativos. En la prueba de precisión, se encontró que para el control negativo el CV fue del 3.7 % para la repetibilidad y del 13 % para la precisión intermedia, con una media de 0.5 DO; para el control positivo, el CV se calculó como 1.1 % para la repetibilidad y 3.8 % para la precisión intermedia, con una media de 3.0 DO.

Con respecto a los resultados del ANOVA para la robustez, hubo diferencias significativas (p < 0.05) cuando se varió la temperatura, sin embargo, la prueba HSD de Tukey mostró que la diferencia era entre los resultados de la incubación del suero a 32 °C y 42 °C, no entre ninguno de ellos y la temperatura estándar de 37 °C; el ANOVA de los resultados de las pruebas variando los tiempos de incubación mostró diferencias significativas (p <0. 01), que la prueba HSD de Tukey mostró entre los tiempos de incubación de 55 min y 65 min, así como entre cada uno de estos tiempos y el estándar de 60 min.

La prueba de selectividad permitió identificar un falso positivo utilizando suero de perros infectados con L. interrogans. La prueba de estabilidad de la muestra mostró una variación significativa en la muestra negativa a partir de 4 h a 25 °C, 24 h en refrigeración (4 °C) y el segundo ciclo de congelación-descongelación, pero no hubo variación en la muestra que se mantuvo congelada (-20 °C) durante 30 días. En las alícuotas del control positivo, no hubo ninguna variación significativa durante todo el procedimiento. La prueba mostró una sensibilidad del 100 % (CI95% 70 - 100 %) y una especificidad del 100 % (CI95% 70 - 100 %).

 I-ELISA con GroEL

El punto de corte se calculó como 1,228 DO utilizando 10 controles negativos. En la prueba de precisión, para el control negativo el %CV fue del 4.6 % para la repetibilidad y del 12.9 % para la precisión intermedia, con una media de 0.7 DO. Para el control positivo, el % CV se calculó en un 8.1% para la repetibilidad y un 16.8% para la precisión intermedia, con una media de 1.3 DO. El ANOVA para la robustez mostró diferencias significativas (p < 0.01) cuando se varió la temperatura, que la prueba HSD de Tukey identificó entre los resultados de los sueros incubados a 42 °C y la temperatura estándar (37 °C) y entre la incubación a 32 °C frente a 42 °C. Con respecto a las pruebas en las que se varió el tiempo de incubación, el ANOVA mostró diferencias significativas en los resultados entre 55 y 60 min, 60 y 65 min, y 55 y 65 min según la prueba HSD de Tukey. La prueba de selectividad permitió identificar un falso positivo de suero de perros infectados con L. interrogans y Salmonella spp. La prueba de estabilidad de la muestra mostró que, para los negativos, empezaron a producirse diferencias significativas a las 168 h a 25 °C, una semana en refrigeración y el segundo ciclo de congelación- descongelación, mientras que para los positivos no hubo diferencias, ni siquiera después de 168 h a 25 °C, 24 h en refrigeración y 7 ciclos de congelación-descongelación. Sin embargo, en ambos casos hubo una curva con variaciones significativas durante las primeras horas de almacenamiento de la muestra, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración. Ni los positivos ni los negativos variaron cuando las muestras se almacenaron en estado de congelación hasta un mes. La prueba mostró una sensibilidad del 44 % (IC95% 18 - 73 %) y una especificidad del 67 % (IC95% 35 - 88 %).

 DISCUSIÓN

La Brucelosis Canina es una enfermedad cuyo riesgo epidemiológico potencial ha sido subestimado, (Hensel et al., 2018; Hubbard et al., 2018; Hull y Schumaker, 2018; Krueger et al., 2014) dando lugar a un escaso interés investigador. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos de diagnóstico para poder abordar este problema, y en este sentido los métodos serológicos juegan un papel importante (Avijgan et al., 2019). En este estudio se evaluaron dos antígenos diferentes de B. canis hasta sus límites en dos inmunoensayos diferentes para establecer las condiciones de rango en las que sirven para detectar los anticuerpos presentes en una muestra, y por tanto, su validez como pruebas diagnósticas, (Andreasson et al., 2015) garantizando que puedan ser aplicadas en el campo.

El primer aspecto que se debe determinar es el punto de corte, ya que éste se utiliza como referencia para diferenciar entre muestras positivas y negativas durante el resto de las pruebas, así como las variaciones en los resultados. El método utilizado se basa en el cálculo probabilístico, que se ha preferido al método empírico (Frey et al., 1998), ya que ofrece una mayor seguridad a la hora de tomar decisiones sobre la positividad de una muestra. A continuación, se realizó una evaluación de la precisión basada en el cálculo de la repetibilidad y la precisión intermedia. Según la literatura, la precisión intermedia no debe superar la repetibilidad duplicada, (Andreasson et al., 2015) sin embargo, esta regla puede ser modificada dependiendo de la naturaleza del método que se valida. Por esta razón, para considerar si la técnica es reproducible, se utilizó como punto de referencia una precisión intermedia y una repetibilidad %CV inferior al 20 % (Jacobson, 1998). Bajo este criterio, tanto CA - iELISA como GroEL - iELISA han mostrado niveles aceptables de repetibilidad y precisión intermedia tanto para muestras positivas como negativas, lo que sugiere que se puede confiar en los resultados.

Al evaluar la robustez de la prueba AC - iELISA, encontramos que las muestras incubadas a diferentes temperaturas no mostraron diferencias estadísticamente significativas en comparación con el estándar; esta variable hace referencia a la interferencia que puede suponer un cambio brusco de temperatura dentro de la incubadora, y por tanto a la necesidad de una buena calibración y estabilidad del equipo. No fue así en el caso de la variación del tiempo de incubación, donde sí se encontraron diferencias. Por lo tanto, es necesario que el operador esté atento a los tiempos de incubación cuando utilice esta prueba para el diagnóstico. En el caso de GroEL - iELISA, hubo diferencias significativas cuando se aumentó la temperatura, así como cuando se modificó el tiempo de incubación, por lo que recomendamos que antes de realizar la prueba, el operador se asegure de que la temperatura del equipo se mantenga por encima de 37 °C y por debajo de 42 °C, así como que se respeten los tiempos de incubación propuestos. Esta variable depende totalmente del operador.

Al evaluar la selectividad de las pruebas, se encontró que la prueba AC - iELISA mostró positividad cruzada con perros infectados con Leptospira spp. En la prueba GroEL - iELISA, hubo una reacción cruzada adicional con Salmonella spp. La reacción cruzada con Leptospira spp ha sido descrita previamente en otros métodos serológicos (Rosa de Bengala) en bovinos vacunados contra esta espiroqueta, (de Faria Naves et al., 2012) además, esto ha sido reportado en perros por comunicación personal (Moreno-Torres A, 2018). Por otra parte, en la única literatura que aborda específicamente esta cuestión, no se encontró ninguna reacción cruzada entre B. canis y Leptospira spp utilizando la prueba RSAT (Krecic, 2019). Este estudio es, por tanto, el primero en demostrar una reacción cruzada entre B. canis y Leptospira spp. Debido a la naturaleza de los antígenos de captura utilizados como referencia, y a la falta de reacciones positivas a los mismos en un método basado en la detección de antígenos de membrana, podemos inferir que los antígenos responsables de la interferencia son de origen citosólico. Esta proteína chaperona se expresa abundantemente en los biofilms de Leptospira spp (Vinod Kumar et al., 2017) lo que sugiere una posible relación entre la formación de estos biofilms y la alta exposición a GroEL que genera anticuerpos contra estas moléculas, aunque esta cuestión queda fuera del alcance de este estudio. Además, se ha descubierto que el GroEL de Salmonella spp es altamente homólogo al GroEL de Escherichia coli, y ambos son altamente homólogos a una proteína presente en Brucella spp., (Panchanathan, 1998; Sekhavati et al., 2015) lo que podría explicar la reacción cruzada en la prueba GroEL - iELISA con Salmonella spp. Para responder a esta pregunta, es necesario abordar el problema desde una perspectiva molecular o bioinformática para determinar las similitudes entre el GroEL de las dos especies de bacterias. Hay otros patógenos que se sabe que causan reacciones cruzadas con Brucella spp. (Mol et al., 2020), esas posibles interferencias en el diagnóstico deberían estudiarse en el futuro para descartar reacciones cruzadas. Uno de los más conocidos es el caso de Yersinia enterocolitica, que interfiere en la detección de B. melitensis y B. abortus; sin embargo, hasta la fecha no hay datos publicados que indiquen que este patógeno afecte a diferentes pruebas serológicas de B. canis. En cambio, Hurvell demostró en 1972 que los antígenos de Yersinia enterocolitica no presentan reacciones cruzadas con las Brucellas rugosas, es decir, B. canis y B. ovis (Hurvell, 1972).

Basándose en los resultados de la prueba de estabilidad, se recomienda que las muestras para AC - iELISA se conserven a 25 °C durante menos de cuatro horas, en refrigeración durante menos de 24 horas, siendo la congelación el método preferido de almacenamiento de las muestras, ya que se obtuvieron resultados fiables incluso después de un mes de congelación. Para el GroEL - iELISA, se recomienda que las muestras no se dejen más de una hora a temperatura ambiente o en refrigeración y que se coloquen inmediatamente en un congelador para garantizar la fiabilidad de los resultados.

La sensibilidad y la especificidad calculadas para AC - iELISA son buenas, pero el intervalo de confianza es demasiado laxo debido al número de muestras utilizadas, por lo que deben interpretarse teniendo esto en cuenta. Lo mismo ocurre con GroEL - iELISA. Dado que para la validación "in-house" de las pruebas serológicas no se requiere la determinación de la sensibilidad y la especificidad según el método descrito por Andreasson (Andreasson et al., 2015), en este trabajo no se incluyó un mayor número de muestras, sino que se decidió calcular estos parámetros con el único fin de obtener un punto de comparación entre las pruebas que nos acerque a posibles escenarios a la hora de utilizarlo en la práctica clínica diaria. En futuros trabajos se deberían analizar más muestras que permitan una estimación más precisa de los parámetros, con el fin de utilizar algunas de estas pruebas para estudios epidemiológicos. Dado que ese no era el objetivo de este estudio, no exploramos más esta cuestión.

Por último, la comparación entre las pruebas presentadas en este estudio refuerza la idea de que el uso de diversos antígenos en una prueba de diagnóstico es preferible al uso de un único antígeno (Wanke et al., 2002). No obstante, la discusión sobre si los antígenos citosólicos son más útiles en el diagnóstico que los antígenos de membrana sigue abierta, ya que se observó un mejor rendimiento en la prueba que utilizó una mezcla de antígenos de ambos orígenes que en la prueba que utilizó únicamente el antígeno citosólico.

La Brucelosis Canina es una enfermedad que requiere más atención e investigación. Así, el desarrollo de métodos de diagnóstico con un adecuado control de calidad permitirá futuras investigaciones que exploren más profundamente el impacto de esta enfermedad en la salud humana y animal y nos conduzca a la mejora de las estrategias de prevención y control siguiendo la filosofía de Una Salud.

 CONCLUSIONES

Teniendo en cuenta los puntos anteriores, se puede concluir que AC-iELISA no sólo funcionó mejor que GroEL-iELISA, sino que, dados los resultados obtenidos, es una prueba de diagnóstico útil para la brucelosis canina en el campo. Dado que no sólo detecta los antígenos de la membrana externa, sino también los antígenos citosólicos, AC - iELISA es más útil para el diagnóstico que las pruebas de inmunoaglutinación. AC- iELISA también permite abordar la respuesta inmunitaria del huésped de forma semicuantitativa (no sólo cualitativa), lo que lo hace potencialmente útil para que el veterinario de primer contacto controle serológicamente al paciente durante el tratamiento.

 FINANCIACIÓN

Este trabajo de investigación fue financiado por la DGAPA-UNAM, proyecto PAPIIT Nº IT201017.

 CONFLICTOS DE INTERESES

Los autores declararon no tener ningún conflicto de intereses con respecto a la investigación, la autoría y/o la publicación de este artículo.

Material Suplementario. Las figuras 1-4 muestran el proceso de purificación de la proteína GroEL. La tabla 1 corresponde a la identificación de la proteína por cromatografía líquida-espectrometría de masas.

 AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Dr. Díaz-Aparicio Efrén por sus amables comentarios a la versión final y a Moreno-Torres Azaf por la comunicación personal sobre la reacción cruzada entre Brucella spp y Leptospira spp. Víctor Palacios-Rodríguez recibió una beca por el Sistema Nacional de Investigadores (SNI) de México, CONACYT.

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Clave: e2020-90.

 Short Communication Development and validation of two immunoassays for the detection of Brucella canis in dogs ABSTRACT:

Canine brucellosis is a cause of reproductive failure and early detection in infected dogs remains a challenge. The aim of the present study was to test two antigens to be used in two different immunoassays for the detection of Brucella canis infection in dogs: one from Brucella canis RM6/66 sonicated crude antigen (CA-iELISA) and the other using the immunodominant protein GroEL (GroEL-iELISA). The cut-off point was determined using sera from infected dogs; subsequently, reproducibility was measured and a coefficient of variation (CV) below 15 % was obtained for negatives and positives with the CA-iELISA, whereas, for the GroEL-iELISA they were higher than 15 %. In the robustness test, there were significant differences for the GroEL-iELISA, but not for the CA-iELISA. The selectivity test showed cross-reactivity with Leptospira interrogans in the CA-iELISA, and with L. interrogans and Salmonella spp. in the GroEL-iELISA. From the sample stability tests, it was demonstrated that samples should be stored at room temperature for no more than 2 hours, at 4 ºC for no more than 24 hours and can be kept at -20 ºC for up to 30 days. Finally, sensitivity and specificity were calculated, resulting in 100 % for both CA-iELISA; sensitivity of 44 % and specificity of 67 % for GroEL-iELISA. In conclusion, the CA-iELSA proved to be better at detecting Brucella canis than the GroEL-iELISA.

 Keywords: Brucella canis Canine Brucellosis GroEL ELISA INTRODUCTION

Brucellosis is the most widespread bacterial zoonosis worldwide (Corbel, 2006). Nevertheless, it is still one of the diseases given the least consideration as a potential cause of chronic - degenerative conditions (Hull and Schumaker, 2018). Canine Brucellosis was described by Leeland Carmichael in 1966, after isolating the agent Brucella canis from Beagles with reproductive problems (Cosford, 2018). It is the most common cause of reproductive failure in dogs, (Hensel et al., 2018) mainly affecting household and shelter dogs (Hubbard et al., 2018) in which fever is accompanied by epididymitis, prostatitis, and reproductive failure, in addition to nonreproductive manifestations such as lymphadenitis, uveitis, endophthalmitis, pyogranulomatous dermatitis, meningoencephalitis, and discospondylitis (Cosford, 2018; Wanke, 2004). Detection is currently based on the isolation of the agent by bacterial culture and seroagglutination (Cosford, 2018). However, serological diagnosis is problematic in the identification of chronic cases, and culture presents a risk to the laboratory personnel (Hull and Schumaker, 2018). Therefore, there is a need to develop new methods for the detection of this microorganism, and serological methods are ideal given their ease of use and demonstrated reliability (Cosford, 2018; Hull and Schumaker, 2018). However, these methods require good quality control, and must therefore be validated before they are used in the field (Andreasson et al., 2015).

The aim of this study is to establish a serological method (I - ELISA) for the detection of Brucella canis antibodies in dogs, using as a capture antigen the 60 kDa chaperone protein GroEL, and a crude sonicated antigen (CA). Finally, to compare the performance of both immunoassays and to determine the conditions for its maximum utility.

 MATERIAL AND METHODS Animals and sera

For this study, we used sera from 10 beagle dogs experimentally infected with B. canis, obtained in a previous work, kindly donated by Efrén Díaz (CENID SAI; INIFAP SAGARPA, México) (Tuxpan Galván, 2015), confirmed by rapid slide agglutination test (RSAT) and bacterial isolation from blood samples. Briefly, animals were inoculated by instillation in the conjunctiva with 5 x 106 CFU/ml of a B. canis field strain, blood samples were taken at different days post infection and cultured in Ruiz-Castañeda medium. Brucella canis identification was performed by routine biochemical tests according to the methodology described by Alton (1988).

Sera from 10 clinically healthy dogs were used, whose last vaccination against any agent was at least six months prior to sampling and which gave a negative result in the RSAT (Carmichael and Joubert, 1987). For selectivity tests, we used three sera from dogs with Leptospira interrogans infections confirmed by the microscopic agglutination test, two sera from dogs recently vaccinated against L. interrogans, Canine Adenovirus type 1 and 2, and Canine Distemper, and serum from a positive dog for gastrointestinal infection with Salmonella spp., as confirmed by culture. All these sera came from the sera stock of the Microbiology and Immunology Department, Faculty of Veterinary Medicine at the National Autonomous University of Mexico.

 Antigens

The crude antigen (CA) was obtained by sonicating the RM6/66 strain of B. canis using a previously described method (de Oliveira et al., 2011); briefly, 2 g of heat inactivated (75 °C for 1 h) B. canis biomass were taken and placed in 10 mL of a solution containing 10 mM HEPES pH 7.5, and store at -20 °C until use. Bacteria were thus sonicated (Vibra Cell VCX 130 - Sonics) (4 pulses of 1 min at 15 Hz) in presence of protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, Saint Luis, Mo). To corroborate cell disruption, a Gram stain was performed. Once the bacterial biomass had been sonicated, it was centrifuged at 700 x g for 30 min at 4 °C in order to obtain the soluble fraction (supernatant).

The purified protein (GroEL) was obtained from the soluble fraction by fast protein liquid chromatography (FPLC) using an anion exchange column (HiTrap Capto Q; GE Healthcare) with liquid chromatography (AKTA Pure; GE Healthcare). The column was buffered with 5 mL of a solution of Tris-HCl (5 mM) and EDTA (10 mM), then the sample was introduced with a flow range of 1 mL/min and washed with the previously described solution. The elution buffer (1 M NaCl) was included in a linear gradient from 0 % to 100 % in nine volumes of 1 mL each. Each fraction was obtained in a volume of 0.5 mL and was resolved by 12 % SDS-PAGE by duplicate and either stained with Coomassie Blue or transferred onto a PVDF membrane for immunoblotting, using sera from infected dogs; further dog anti IgG as secondary antibody (1:10000) and ECL West femto as substrate (ThermoFisher, Carlsbad, California) were used. Subsequently, fractions were concentrated 3 times in an Amicon ultra 50kDa (Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) and resuspended in PBS and two fractions containing two bands each (between 55 kDa and 70 kDa), were selected to resolve them on a gel using isoelectric focusing (IEF) (a total of 20 µg of protein) followed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and the antigenicity of each spot was verified by Western blotting with the aid of sera from B. canis infected dogs. Three spots were identified as GroEL by liquid chromatography-mass spectrometry as described in a previous work, with a coverage of 29, 51 and 21 % for each spot (Morales Aguilar, 2016) (Supplementary material).

 iELISA protocol using the sonicated crude antigen

The ELISA using crude antigen (CA-iELISA) was done on 96-well mid-binding polystyrene plates (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich), adding 240 ng of antigen diluted in 100 µL per well in phosphate buffer solution (PBS); this was homogenized at 100 rpm for 5 min and incubated at 37 °C for 17 +/- 1 h. It was washed three times with 200 µL of a solution of PBS + Tween 20 (Tween 20; Sigma-Aldrich) at 0.1 % (PBS-Tween 20). A solution of bovine serum albumin (Bovine serum albumin; Sigma-Aldrich) diluted to 1 % in PBS (100 µL per well) was added, then incubated for 60 min at 37 °C and washed three times with 200 µL of Tween 20 at 0.1 %. The serum diluted in PBS 1:250 in 100 µL was added, then incubated at 37 °C for 60 min, after which it was washed three times with 200 µL of Tween 20 at 0.1 %. A 100 µL solution of the rabbit anti-canine IgG conjugated with horseradish peroxidase secondary antibody (Rabbit anti-Canine IgG (H+L) secondary antibody, HRP; Invitrogen), diluted 1:2000 in PBS, was added (ABTS solution; Roche), incubated at 37 °C for 60 min, and washed three times with 200 µL of Tween 20 at 0.1 %. Finally, 100 µL of ABTS were added (Sigma-Aldrich) to each well in the dark and incubated with the well covered with aluminum foil, at room temperature in orbital agitation at 100 rpm for 25 min. The plates were read using an ELISA reader (Biotek Instruments) at a wavelength of 405 nm using the program Gen5 (https://www.biotek.es/es/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/).

 iELISA protocol using GroEL

For the technique using GroEL as the capture antigen (GroEL - iELISA), a 96-well plate (Nunc-Immuno Micro Well MaxiSorp; Sigma-Aldrich) was sensitized using 10 ng of purified GroEL protein diluted in sufficient carbonate buffer solution (0.05 M, pH 9.6) to reach 100 µL volume per well. The plate was placed in orbital agitation at 100 rpm for 5 min, covered with parafilm (Parafilm M; Merck) and incubated at 4 °C for 17 ± 1 h, then washed three times with 200 µL of Tween 20 at 0.1 %. 100 µL of serum diluted 1:500 in PBS with bovine serum albumin at 1 g/L (0.1 M, pH 7) was added, covered with parafilm, incubated for 1 h at 37 °C, and washed three times with Tween 20 at 0.1 %. 100 µL per well of a 1:2000 dilution of the horseradish peroxidase goat anti-canine IgG antibody (Goat anti-Canine IgG (H+L) secondary antibody, HRP; Invitrogen) diluted in PBS (0.1 M, pH 7), was added, covered with parafilm and incubated for 1 h at 37 °C, then washed three times with Tween 20 at 0.1 %. Finally, 100 µL of ABTS was added to each well in the dark, covering the plate with aluminum foil and placing it in orbital agitation at 100 rpm for 25 min. The reading was taken on an ELISA reader (Bio-Tek/ELX808; Biotek) at a wavelength of 405 nm using Gen5 software.

 In-house validation protocol

The cutoff point was determined using a previously described method (Frey et al., 1998) and calculated using the following equation:

CUTOFF POINT= X-+SD t1+(1/n)

Where X- is the average of the results obtained from a series of negative controls, SD is the standard deviation of that series of results, t is the percentile (1 - α) of a one-tailed Student’s t distribution with (n - 1) degrees of freedom, and n is the number of controls tested. The results are considered positive for B. canis infection if they are above the result of this calculation. Next, precision was evaluated by calculating intermediate precision and repeatability using the supplemental material from a guide, (Andreasson et al., 2015) where the Coefficient of Variation (%CV) is calculated from a series of independent measurements on different days (Intermediate Precision) as well as a series of simultaneous measurements (Repeatability). In addition, the mean and standard deviation of these parameters were calculated, using a positive control and a negative control. Repetitions were done on five different days, five times each. The robustness of the tests was evaluated for positive and negative sera, varying by +/- 5 °C the incubation temperature of the reference sera, using 37 ºC as a reference temperature. Similarly, the incubation time was varied by +/- 5 min compared to the standard; the results were compared using an ANOVA and significant differences were determined by Tukey’s Honestly Significant Difference (HSD) test (Andreasson et al., 2015). Selectivity was evaluated using sera from dogs positive for diseases other than canine Brucellosis. To evaluate the sample stability, 19 aliquots were prepared from a positive control and a negative control and were subjected to a freeze-thaw process for comparison using the following protocol: (Andreasson et al., 2015)

Aliquots 1 to 6 were thawed at room temperature for 2 h then refrozen for 12 h.

Numbers 2 through 6 were thawed for 2 h and refrozen for 12 h.

Numbers 3 through 6 thawed for 2 h and refrozen for 12 h.

Numbers 4 through 6 thawed for 2 h and refrozen for 12 h.

Numbers 5 and 6 thawed for 2 h and refrozen for 12 h.

Aliquot 6 was thawed for 2 h. and frozen again for 12 h.

Samples 7 to 12 were kept at room temperature from the start of the evaluation; one aliquot was moved to the freezer after 1 h, a second aliquot after 2 h, a third aliquot after 4 h, a fourth aliquot after 24 h, a fifth aliquot after 72 h, and the sixth aliquot after 168 h.

Aliquots 13 to 18 were kept at 4 °C from the start of the evaluation and were moved to the freezer using the same process as described in point 7 above.

Aliquot 19 was kept at -20 °C and then tested one month later.

Finally, sensitivity and specificity were tested using 10 negative and 10 positive sera, adjusting the results according to the previously described formula to obtain the 95 % Confidence Interval (IC95%) (DasGupta et al., 2001; Jacobson, 1998), using the following calculation:

A = 2r + 1.962

B=1.961.962+4r(1-p)

C = 2( + 1.962)

Constructing the confidence interval as (A-B)/C, (A+B)/C.

 RESULTS I-ELISA using sonicated crude antigen

The cutoff point at 0.98 DO was calculated using 10 negative controls. In the precision test, we found that for the negative control the CV was 3.7 % for repeatability and 13 % for intermediate precision, with a mean of 0.5 DO; for the positive control, CV was calculated as 1.1 % for repeatability and 3.8 % for intermediate precision, with a mean of 3.0 DO.

With respect to the ANOVA results for robustness, there were significant differences (p < 0.05) when temperature was varied, however, the Tukey’s HSD test showed that the difference was between results from the incubation of serum at 32 °C and 42 °C, not between either of these and the standard temperature of 37 °C; the ANOVA of the results of tests varying incubation times showed significant differences (p < 0.01), which the Tukey HSD test showed to be between the incubation times of 55 min and 65 min, as well as each of these times compared to the standard 60 min.

The selectivity test allowed the identification of a false positive test using serum from dogs infected with L. interrogans. The sample stability test showed significant variation in the negative sample starting at 4 h at 25 °C, 24 h in refrigeration (4 °C), and the second freeze-thaw cycle, but there was no variation in the sample that was kept frozen (-20 °C) for 30 days. In the positive control aliquots, there was no significant variation during the whole procedure. The test showed a sensitivity of 100 % (CI95% 70 - 100 %) and specificity of 100 % (CI95% 70 - 100 %).

 I-ELISA using GroEL

The cutoff point was calculated as 1.228 DO using 10 negative controls. In the precision test, for the negative control the %CV was 4.6 % for repeatability and 12.9 % for intermediate precision, with a mean of 0.7 DO. For the positive control, the %CV was calculated at 8.1% for repeatability and 16.8 % for intermediate precision, with a mean of 1.3 DO. The ANOVA for robustness showed significant differences (p < 0.01) when temperature was varied, which the Tukey HSD test identified to be between the results of sera incubated at 42 °C and the standard temperature (37 °C) and between incubation at 32 °C versus 42 °C. With respect to the tests where incubation time was varied, the ANOVA showed significant differences in results between 55 and 60 min, 60 and 65 min, and 55 and 65 min according to the Tukey HSD test.

The selectivity test allowed the identification of a false positive test of serum from dogs infected with L. interrogans and Salmonella spp. The test of sample stability showed that for negatives, significant differences began to occur at 168 h at 25 °C, one week in refrigeration, and the second freeze-thaw cycle, while for the positives, there were no differences, even after 168 h at 25 °C, 24 h in refrigeration, and 7 freeze-thaw cycles. However, in both cases there was a curve with significant variations during the first hours of sample storage, both at room temperature and in refrigeration. Neither positives nor negatives varied when samples were stored in a frozen state for up to a month. The test showed a sensitivity of 44 % (IC95% 18 - 73 %) and specificity of 67 % (IC95% 35 - 88 %).

 DISCUSSION

Canine Brucellosis is a disease whose potential epidemiological risk has been underestimated, (Hensel et al., 2018; Hubbard et al., 2018; Hull and Schumaker, 2018; Krueger et al., 2014) resulting in little research interest. It is therefore necessary to develop diagnostic methods so that this problem can be addressed, and in this respect serological methods play an important role (Avijgan et al., 2019). In this study, two different antigens from B. canis were evaluated to their limits in two different immunoassays to establish the range conditions under which they serve to detect the antibodies present in a sample, and therefore, their validity as diagnostic tests, (Andreasson et al., 2015) guaranteeing that they can be applied in the field.

The first aspect that must be determined is the cutoff point, since this is used as a reference for differentiating between positive and negative samples during the rest of the tests, as well as the variations in the results. The method used it is based on probabilistic calculations, which has been preferred over the empirical method (Frey et al., 1998) since it offers increased certainty when making decisions about the positivity of a sample. Then, an evaluation of the precision was done based on the calculation of the repeatability and intermediate precision. According to literature, the intermediate precision should not exceed the repeatability doubled, (Andreasson et al., 2015) however, this rule can be modified depending on the nature of the method being validated. For this reason, in order to consider whether the technique is reproducible, an intermediate precision and repeatability %CV below 20 %, were used as reference points (Jacobson, 1998). Under this criterion, both CA - iELISA and GroEL - iELISA have shown acceptable levels of repeatability and intermediate precision for both positive and negative samples, suggesting that the results can be confided in.

When evaluating the robustness of the CA - iELISA test, we found that the samples incubated at different temperatures did not show statistically significant differences compared to the standard; this variable refers to the interference that a sudden change in temperature inside the incubator may occur, and therefore the need for a good calibration and stability of the equipment. This was not true of varying incubation time, where differences were found. It is therefore necessary that the operator is attentive to the incubation times when using this test for diagnosis. In the case of GroEL - iELISA, there were significant differences when temperature was increased, as well as when incubation time was modified, so we recommend that before carrying out the test, the operator ensures that the temperature of the equipment is kept above 37 °C and below 42 °C, as well as adhering to the proposed incubation times. This variable is totally operator- dependent.

When evaluating the selectivity of the tests, it was found that the CA - iELISA test showed cross-positivity with dogs infected with Leptospira spp. In the GroEL - iELISA test, there was an additional cross-reaction with Salmonella spp. The cross-reaction with Leptospira spp. has been described previously in other serological methods (Rose Bengal) in cattle vaccinated against this spirochete, (de Faria Naves et al., 2012) furthermore, this has been reported in dogs by personal communication (Moreno-Torres A, 2018). Moreover, in the only literature specifically addressing this question, no cross-reaction was found between B. canis and Leptospira spp. using the RSAT test (Krecic, 2019). This study is therefore the first to demonstrate a cross-reaction between B. canis and Leptospira spp. Due to the nature of the capture antigens used as a reference, and the lack of positive reactions to them in a method based on the detection of membrane antigens, we can infer that the antigens responsible for the interference are of cytosolic origin. This chaperone protein is expressed abundantly in biofilms of Leptospira spp.(Vinod Kumar et al., 2017) which suggests a possible relationship between the formation of these biofilms and the high exposure to GroEL that generates antibodies against these molecules, though this question is beyond the scope of this study. In addition, it has been found that GroEL from Salmonella spp. is highly homologous to GroEL from Escherichia coli, and both are highly homologous to a protein present in Brucella spp., (Panchanathan, 1998; Sekhavati et al., 2015) which could explain the cross-reaction in the GroEL - iELISA test with Salmonella spp. To answer this question, it is necessary to address the problem from a molecular or bioinformatics perspective to determine the similarities between GroEL of the two species of bacteria. There are other pathogens that are known to cause cross reactions with Brucella spp. (Mol et al., 2020), those possible interference in the diagnosis should be studied in the future to rule out cross reactions. One of the best known is the case of Yersinia enterocolitica, which interferes with B. melitensis and B. abortus detection; however, to date there is no published data that indicates that this pathogen affects different B. canis serological tests. Instead, Hurvell in 1972 demonstrated that Yersinia enterocolitica antigens does not cross-react with rough Brucella, namely B. canis and B. ovis (Hurvell, 1972).

Based on the stability test results, it is recommended that samples for CA - iELISA be kept at 25 °C for less than four h, in refrigeration for less than 24 h, with freezing being the preferred sample storage method, since reliable results were yielded even after one month of freezing. For the GroEL - iELISA, it is recommended that samples be left no more than one h at room temperature or in refrigeration and that they be placed immediately in a freezer to ensure that the results are reliable.

The sensitivity and specificity calculated for CA - iELISA are good, but the confidence interval is too lax because of the number of samples used, so they should be interpreted with this in mind. The same is true for GroEL - iELISA. Since for the “in-house” validation of serological tests, the determination of sensitivity and specificity is not required according to the method described by Andreasson (Andreasson et al., 2015), in this work a larger number of samples was not included; instead, we decided to calculate these parameters with the sole purpose of obtaining a point of comparison between the tests that brings us closer to possible scenarios when using it in daily clinical practice. In future work, more samples should be analyzed to allow more precise estimation of the parameters, in order to use some of these tests for epidemiological studies. Since that was not the objective of this study, we did not explore this issue further.

Finally, the comparison between the tests presented in this study, reinforces the idea that the use of diverse antigens in a diagnostic test is preferable to the use of a single antigen (Wanke et al., 2002). Nonetheless, the discussion of whether cytosolic antigens are more useful in diagnosis than membrane antigens remains open, since better performance was observed in the test that used a mixture of antigens of both origins than the test that used cytosolic antigen alone.

Canine brucellosis is a disease that requires more attention and research. Thus, the development of diagnostic methods with adequate quality control will allow future investigations that explore more deeply the impact of this disease on human and animal health and lead us to the improvement of prevention and control strategies following the One Health philosophy.

 CONCLUSIONS

Considering the points above, it can be concluded that CA - iELISA not only performed better than GroEL - iELISA, but also that, given the results obtained, it is a useful diagnostic test for canine brucellosis in the field. Since it detects not only external membrane antigens, but also cytosolic antigens, CA - iELISA is more diagnostically useful than immunoagglutination tests. CA - iELISA also allows us to address the immune response of the host semi-quantitatively (not just qualitatively), making it potentially useful for the first contact veterinarian monitoring the patient serologically during treatment.

 FUNDING

This research work was financed by DGAPA-UNAM, PAPIIT project No. IT201017.

 CONFLICTS OF INTEREST

The authors declared no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article.

Supplementary material Figures 1-4 show the GroEL protein purification process. Table 1 corresponds to protein identification by liquid chromatography-mass spectrometry.

 ACKNOWLEDGEMENTS

We thank Dr. Díaz-Aparicio Efrén for kindly commenting on the final version and Moreno- Torres Azaf for the personal communication regarding the cross-reaction between Brucella spp. and Leptospira spp. Victor Palacios-Rodríguez received a scholarship from the Mexican National System of Researchers (SNI), CONACYT.

Code: e2020-90.