avAbanico veterinarioAbanico vet2007-428X2448-6132Sergio Martínez González10.21929/abavet2021.300103Artículos originalesEvaluación de extractos vegetales para el control de Oesophagostomun dentatum en cerdos pelón mexicano0000-0002-1645-9858García-MunguíaCarlos¹0000-0001-9358-4700PuentesCarolina¹0000-0001-5450-3197García-MunguíaAlberto*20000-0002-7963-4705Haubi-SeguraCarlos20000-0002-5273-0393Sánchez-ChiprésDavid30000-0001-5244-7996García-MunguíaOtilio4Departamento de Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Guanajuato. Carretera Irapuato-Silao km 9, CP 36500 Irapuato, Guanajuato, México. Universidad de GuanajuatoDepartamento de Veterinaria y ZootecniaUniversidad de GuanajuatoIrapuatoGuanajuatoMexicoCentro de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma de Aguascalientes. Av Universidad 940, col. Ciudad Universitaria, CP 20131, Aguascalientes, Aguascalientes. México. Universidad Autónoma de AguascalientesUniversidad Autónoma de AguascalientesAguascalientesAguascalientesMexicoCentro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara. Camino Ramón Padilla Sánchez 2100 Nextipac, 45200 Zapopan, Jalisco, México, Universidad de GuadalajaraCentro Universitario de Ciencias Biológicas y AgropecuariasUniversidad de GuadalajaraZapopanJaliscoMexicoCentro de Ciencias Económico Administrativas, Universidad Autónoma de Aguascalientes Av Universidad 940, col. Ciudad Universitaria, CP 20131, Aguascalientes, Aguascalientes. México. Universidad Autónoma de AguascalientesCentro de Ciencias Económico AdministrativasUniversidad Autónoma de AguascalientesAguascalientesMexico
Autor responsable: García-Munguía Carlos, *Autor para correspondencia: García-Munguía Alberto, correo electrónico. almagamu@hotmail.com. cagamu@hotmail.com, puentecaro@hotmail.com, almagamu@hotmail.com, dhaubi@yahoo.com. chipres9@hotmail.com, einsteinoti@hotmail.com
Clave:2020-38.
30042021Jan-Dec202111e1030309202021122020Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsRESUMEN:
En México, el Oesophagostomum dentatum es considerado uno de los principales endoparásitos gastrointestinales que afecta a la raza de mayor importancia en la porcicultura rural [Cerdo Pelón Mexicano (CPM)]. En esta investigación se evaluó la eficacia biológica in vitro de extractos vegetales de jengibre, hierbabuena, tomillo y orégano, con el objetivo de encontrar nuevas alternativas de carácter natural para el control de Oesophagostomum dentatum; siendo comparada su eficiencia con ivermectina (IVM) y dimetilsulfóxido (DMSO). Durante la investigación, se colectaron 380 muestras de excretas (extraídas directamente del ano) de CPM, con un peso promedio (±DE) 40±5 kg por animal. Dichas muestras fueron analizadas mediante la técnica de McMaster, logrando identificar huevos de Oesophagostomum dentatum. La evaluación de la eficacia de los tratamientos se realizó en microplacas de cultivo celular incubadas durante 48 h a 25±1 ºC utilizando diferentes dosis de los extractos vegetales y comparando su eficacia de control con IVM y DMSO. Obteniendo que la efectividad biológica del extracto de jengibre (3%) es similar al de la IVM (1%), logrando la eliminación e inmovilización de la larva de Oesophagostomum dentatum en un 62%. Mientras que los extractos de orégano, tomillo y hierbabuena presentaron un porcentaje de efectividad biológica menor al 20%.
Durante los últimos años, en México, la producción porcícola ha generado más de 350,000 empleos directos y 1.7 millones de empleos indirectos, provocando un crecimiento exponencial del 10.79 %, consecuencia de los aumentos de producción y una mejoría de precios en el mercado para el consumo de esta carne (Rebollar et al., 2016). Una de las actividades más importantes dentro del país es la porcinocultura rural, siendo el cerdo Pelón Mexicano (CPM) uno de sus grandes protagonistas, pues éste ha sido caracterizado principalmente por su rusticidad y variada alimentación (Lemus y Ly, 2010).Sin embargo, este tipo de producción se ve afectada por la presencia de parásitos que limitan el potencial productivo de los cerdos, provocando la pérdida del apetito y respuesta inmunológica; consecuentemente a ello una disminución en los pesos vivos y alteraciones en los índices de conversión alimenticia (Louie et al., 2007).
Es importante resaltar que la prevalencia de la parasitosis depende exclusivamente del sistema de manejo, de las condiciones de sanidad e higiene y de diferentes tipos de variables, como el clima, temperatura y humedad, que influyen en los ciclos de vida de los parásitos (Frontera et al., 2009); donde uno de los parásitos con mayor prevalencia en la producción porcícola es Oesophagostomum dentatum (Cordero et al., 2000). Actualmente los métodos de control que se han optado para este tipo de parasitosis han sido cada vez menos efectivos, debido a que estos nematodos han tenido una rápida evolución y desarrollo de resistencia contra los productos químicos utilizados para su control, lo que representa un riesgo para la salud humana (Taylor et al., 2009a). En la actualidad tres grandes familias de antiparasitarios son usados frecuentemente por los porcicultores, las lactonas macrocíclicas (IVM, moxidectina, doramectina), imidazoles tetrahidropirimidina (levamisol, moratel) y benzimidazoles (fenbendazol, oxfendazol y albendazol), dependiendo de las áreas en las que se desarrolla la producción (Encalada et al., 2014). El abuso de estos productos químicos ha ocasionado un problema de resistencia a los antiparasitarios (Kaplan y Vidyashankar, 2012); además, su mal uso puede ocasionar que estos lleguen al medio ambiente como un compuesto igual (sin cambios) o como un metabolito; para después transportarse y distribuirse en el agua, sedimentos, suelo y la flora (Horvat et al., 2012), causando alteraciones considerables en el ecosistema.
Por esta razón existe un creciente interés en explorar alternativas naturales, con propiedades capaces de actuar como bacteriostáticos, bactericidas y antiparasitarias (Aguilera, 2012). Las plantas, como parte de su metabolismo, sintetizan distintos componentes llamados metabolitos secundarios (Dávila et al., 2017). Diversas investigaciones realizadas han mostrado una gran diversidad de plantas que poseen estos metabolitos capaces de inhibir el crecimiento y desarrollo de patógenos (Rizo et al., 2017).
El objetivo del presente estudio fue evaluar la eficacia biológica de distintos extractos vegetales, como: jengibre (Zingiber officinale), orégano (Origanum vulgare), tomillo (Thymus) y hierbabuena (Mentha spicata); reportados anteriormente por sus compuestos activos capaces de actuar como bactericidas; comparándolos con productos comerciales que se utilizan actualmente para el control de Oesophagostomum dentatum presentes en CPM.
MATERIAL Y MÉTODOS
Zona de estudio: el estudio se desarrolló en el Centro de Conservación del Cerdo
Pelón Mexicano y en el Laboratorio de Parasitología y Control Biológico, de la
División de Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato. Las muestras fueron
recolectadas de CPM, de pesos promedios 40±5 kg, originarios de zonas rurales del
municipio de Huehuetla, Hidalgo y Zacapoaxtla, Puebla, México. Se recolectaron un
total de 380 muestras tomadas del recto y fueron colocadas en bolsas de polietileno
debidamente identificadas (Aguilar et
al, 2016); siendo éstas trasladadas al laboratorio, donde
fueron almacenadas a una temperatura de 4±1ºC hasta su procesamiento, el cual no fue
mayor a 48 h.
Material vegetativo: se colectaron hojas frescas de hierbabuena (Mentha
spicata), tomillo (Thymus) y orégano (Origanum
vulgare) (1kg aproximadamente por muestra) en el municipio de
Zacapoaxtla, Puebla, localizado a una altitud de 1825 m. s.n. m., así como bulbos de
jengibre (Zingiber officinale) (2 kg aproximadamente) en el
municipio de Huehuetla, Hidalgo, localizado a una altitud de 520 m. s. n. m. El
material se almacenó y trasladó en refrigeración a 4°C en un mini refrigerador
portátil (Chefman / RJ48-BLACK; Cooling & Heating Company, United States), para
evitar cambios en su composición (Salem et
al., 2006). Posteriormente se sometieron a un proceso de
secado bajo la sombra durante una semana, y finalmente tanto las hojas y bulbos se
trituraron en un molino semi-industrial a un tamaño de 1 mm aproximadamente.
Obtención del extracto hidro-alcohólico (HA): por cada muestra se utilizaron 100
g y se sometieron a un proceso de maceración con una mezcla de agua y metanol (70:30
v/v) durante 24 h, posteriormente se filtró la solución mediante diferentes filtros,
utilizando (gasa y papel filtro) para obtener un extracto libre de impurezas. Una
vez obtenido el extracto, se congeló a -42 °C y finalmente se realizó el proceso de
liofilización (liofilizador 7670520; LABCONCO, Kansas City, United States). El
extracto liofilizado fue congelado para su posterior uso (Salem et al., 2006).
Material biológico: se realizó el diagnóstico parasitológico mediante la técnica
de almacenamiento anaeróbico de huevos, descripta por (Coles et al., 2006) modificada; que consiste
en procesar las muestras mediante la técnica de sedimentación que se encuentra en el
contenido fecal y permitir que los huevos de parásitos se concentren en el fondo del
tubo falcón; siendo así que en cada tubo falcón se colocaron 30 mL de agua y 4 g de
heces, se homogenizó la muestra, vertiéndola en un tamiz y centrifugó por 5 min a
300 rpm. Posteriormente se realizó la técnica de flotación con 30 mL de solución
glucosada con densidad de 1:200 (Cringoli et
al., 2004); logrando de esta manera que los huevos de
parásitos del fondo del tubo falcón floten por consecuencia de la densidad de la
solución; nuevamente se centrifugó la mezcla por 5 min a 300 rpm. Finalmente se
realizó nuevamente la técnica de sedimentación con 30 mLde agua destilada para
concentrar los huevos en el fondo del tubo centrifugando a 300 rpm y establecer la
concentración de huevos por mL de agua destilada esterilizada.
Técnica de McMaster: se realizó la técnica coproparasitoscópica de McMaster,
utilizando una solución saturada de Sheather con una gravedad específica de 1.200
para estimar la cantidad de huevos por g de excremento, siendo la gravedad apropiada
para llevar a cabo la técnica (Cringoli et
al., 2004). Se utilizaron 2 g de excremento y 28 mL de
solución saturada; la muestra se homogenizó y se colocó en la cámara de McMaster
(MM-OP; PROLAB, Jalisco, México), utilizando una pipeta con una gasa como filtro,
evitando la obstrucción en la revisión de la muestra. Se colocó el volumen necesario
para realizar la lectura de un lado de la cámara, dejando reposar 2 min antes de ser
observada al microscopio y llevar a cabo el conteo de huevos (Rodríguez et al., 2016).
Para la estimación del número de huevos por g de excremento se ajustó con el volumen total obtenido de mezclar el excremento y la solución de 30 mL; considerando que cada compartimiento de la cámara mide 1 cm2 con una altura de 0.15 cm, por lo que la lectura de ambos compartimientos es de 0.30 mL del volumen inicial total de 30 mL (Rodríguez et al., 2016). Se obtuvo la concentración de huevos por g de heces del parásito encontrados por medio de la fórmula de McMaster (Bowman, 2013).
Los huevos de parásito fueron identificados con las claves morfológicas (Coffin, 1952), y el diagnóstico larvario se realizó con las claves morfológicas de Van Wyk et al., (2004), pudiéndose observar la extremidad craneal de las larvas, los apéndices terminales y la morfología de la cola.
Diseño experimental: el experimento se estableció bajo un diseño completamente al
azar de 19 tratamientos de 20 repeticiones cada uno, teniendo en total de 380
unidades experimentales; cada unidad experimental constó de 1200 µL (1100 µL de
extracto de jengibre más 100 µL de solución con 70 larvas de nematodos). Cada unidad
experimental estuvo conformada por un total de 100 µL de nematodos vivos (con un
promedio de 70 larvas).
Prueba de inhibición de la migración larvaria: se llevó a cabo un cultivo
larvario para llevar a los nematodos a la tercera etapa de la larva; para ello se
les brindó las condiciones necesarias para la eclosión del huevo, realizando
modificaciones a conveniencia a la técnica de McArthur et al., (2015). Se colocó excremento en recipientes de plástico
perforados, con el objetivo de brindar un ambiente aeróbico, se adicionó aserrín
estéril y se homogenizó el excremento adicionando agua destilada estéril. Se encubó
la mezcla a 23-25 ºC durante 10 d, con una evaluación visual diaria en caso de
requerir adición de humedad y oxigenar las muestras, removiendo el cultivo con ayuda
de una espátula. Una vez concluido el tiempo de incubación, se colocó el cultivo en
un embudo de Baermann; de esta manera se separaron las larvas de Oesphagostomum
dentatum del contenido fecal. Tras un día en el embudo se obtuvo el líquido y
mediante centrifugación se concentraron las larvas, para posteriormente realizar su
conteo y diluciones, siendo identificadas con las claves morfológicas descriptas por
Quiroz (2011).
Dosis y número de aplicaciones: se realizaron evaluaciones con dosis de extracto
de jengibre (Zingiber officinale) al 0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.9%, 1%, 3% (Gawel et al., 2003); orégano (Origanum vulgare)
al 1%, 3% y 5%, según lo mencionado por Borbolla y Velásquez, 2004 (citado en Guerra et al., 2008); tomillo (Thymus
vulgaris) al 1%, 3% y 5% (Ramos y
Hernández, 2018); hierbabuena (Mentha spicata) al 1%, 3%
y 5% (Lagarto et al, 1997); comparando el
efecto de cada uno con el testigo de agua, DMSO 5% (Rendal et al., 2004) e IVM al 1% (Chávez
et al., 2006).
Para la dilución de los nematodos se utilizó una pipeta graduada en 100 µL, con la cual se extrajo la muestra recogida del embudo, depositados en cada pozo de la microplaca celular de 1200 µL de volumen, una muestra de 100 µL de nematodos; repitiendo el mismo procedimiento para cada unidad experimental. Para las unidades experimentales de los extractos de los tratamientos orgánicos a evaluar, se utilizó una solución madre del extracto al 5% (equivalente a 2 mL de extracto + 38 mL de agua destilada = 40 mL de solución); calculando así los equivalentes a cada porcentaje como se mencionaron anteriormente para cada unidad experimental según su porcentaje de inclusión.
Para la dilución de cada dosis de tratamiento se depositó la cantidad necesaria de agua destilada hasta completar los 1200 µL de volumen, en cada unidad experimental. Al tratamiento Testigo se le adicionó con 100 µL de nematodos y un total de 1100 µL de agua destilada.
Durante el experimento se realizó una sola aplicación de los antiparasitarios, y con ayuda de un contador manual se realizó el conteo de los nematodos vivos y muertos de cada unidad experimental, a través de un microscopio con el objetivo 10x y 40x.
Análisis estadístico: para la evaluación de cada antiparasitario se determinó su
efectividad, comparándola con el grupo control (Barrere et al., 2013). Los porcentajes de mortalidad se ajustaron con la
fórmula de Abbott (Abbott,1987), y se realizó
un análisis de varianza de los diferentes tratamientos y se hizo una comparación de
medias mediante una prueba de Tukey al 95% de confianza, con el paquete estadístico
Statgraphics 9.0 (Cosialls et al., 2000).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El porcentaje de efectividad biológica de los diferentes antiparasitarios evaluados, fue el
siguiente: primera evaluación (0 h), fue de 0% en cada tratamiento; esto por ser el
primer conteo después de la aplicación. Para la segunda evaluación (24 h después de
la aplicación de los tratamientos), no se mostraron diferencias significativas en la
mortalidad de nematodos entre los tratamientos evaluados. En la tercera evaluación
(48 h después de la aplicación de los tratamientos), se observó que el porcentaje de
efectividad biológica de los diferentes tratamientos aumentó; sin embargo la IVM
(1%) y el extracto de jengibre (Zingiber officinale) (3%) fueron los que presentaron
mayor efectividad para el control de Oesophagostomum dentatum
(cuadro 1).
Porcentaje de Efectividad Biológica de los desparasitantes y extractos vegetales evaluados
Desparasitante
% Inclusión
Evaluación 1 (0 horas)
Evaluación 2 (24 horas)
Evaluación 3 (48 horas)
%
T1: Testigo H2O
- - -
0
0
0
T2: Ivermectina
1
0
32.56
62.72
T3: DMSO
5
0
0
10.02
T4: Jengibre
0.1
0
1.19
2.08
T5: Jengibre
0.3
0
2.37
5.19
T6: Jengibre
0.5
0
6.15
11.46
T7: Jengibre
0.7
0
12.74
24.27
T8: Jengibre
0.9
0
19.54
36.09
T9: Jengibre
1
0
22.69
45.36
T10: Jengibre
3
0
32.54
62.93
T11: Hierbabuena
1
0
1.67
3.04
T12: Hierbabuena
3
0
2.54
5.98
T13: Hierbabuena
5
0
4.66
9.53
T14: Tomillo
1
0
1.49
2.49
T15: Tomillo
3
0
2.71
5.80
T16: Tomillo
5
0
3.85
8.03
T17: Orégano
1
0
3.29
6.48
T18: Orégano
3
0
5.48
11.18
T19: Orégano
5
0
8.80
17.02
En la figura 1 se observa que la efectividad biológica
del extracto de jengibre (Zingiber officinale) (3%) es similar al de la IVM (1%), en
un 62%; teniendo este extracto un crecimiento exponencial del 26.76% en promedio al
ir aumentando su porcentaje de concentración; mientras que los extractos de orégano
(Origanum vulgare), tomillo (Thymus) y
hierbabuena (Mentha spicata), mantienen un porcentaje de
efectividad biológica menor al 20%; siendo estos poco eficaces en la mortalidad del
nematodo evaluado. Según lo reportado por un estudio de Taylor et al. (2009a), se ha comprobado una resistencia
múltiple de los nematodos gastrointestinales a las familias principales de
antiparasitarios (benimidazoles, imidazoles y lactosas microcíclicas). Geurden et al. (2015), reportaron que la IVM ha
sido uno de los desparasitantes más utilizados en los últimos 40 años, debido a la
resistencia que los parásitos desarrollan en diferentes sitios de Alemania, Francia,
Inglaterra e Italia. Se estudiaron 40 Unidades de Producción Animal (753 animales),
llevando un registro de los huevos observados en el excremento y observando una
disminución de la efectividad de la IVM y la moxidectina en las 8 Unidades de
Producción Animal.
Porcentaje de Efectividad Biológica de cada desparasitante utilizado sobre las larvas de Oesophagostomum dentatum durante la evaluación 1 (a las 24 h después de aplicado el tratamiento) y en la evaluación 2 (a las 48 h después de aplicado el tratamiento)
dda: después de la aplicación
En México, Alonso et al., (2015) evaluaron en 21 Unidades de Producción Animal en el estado de Veracruz, durante el periodo de enero 2012- abril 2013; entre las cuales únicamente en 2 Unidades de Producción Animal tienen parásitos susceptibles a la IVM, siendo las otras 15 las que presentan resistencia; además lograron identificar mediante cuestionarios que este problema se origina principalmente porque se realiza una práctica de desparasitación inadecuada; siendo uno de los principales problemas en el estado de Guanajuato, ya que los productores indican desparasitar sin un control adecuado, lo que generó que únicamente 2 Unidades de Producción Animal presenten parasitosis susceptibles a la IVM. Paraud et al., (2016) ha comprobado en Francia, que esto último no sólo puede modificar la efectividad de IVM, sino que además es posible la existencia de una resistencia cruzada, reportando una resistencia a las lactonas macrocíclicas en ovinos, ya que demostraron la primera resistencia múltiple de nematodos gastrointestinales contra la misma familia de antiparasitario; pudiendo ser un problema en el presente estudio, debido a que el 60% de las Unidades de Producción Animal evaluadas presentaron resistencia a la IVM, y la resistencia cruzada en Francia se observó en granjas sospechosas de resistencia.
Paradójicamente investigaciones realizadas en México por Rizo
(2017), muestran la gran diversidad de plantas que presentan metabolitos
capaces de inhibir el crecimiento y desarrollo de patógenos (Phytophthora
ssp., Colletotrichum gloeosporioides, Moniliophthora roreri); una de
estas plantas evaluadas ha sido el extracto de jengibre (Zingiber
officinale). Estudios reportados por Lin et al. (2010), han comprobado el efecto del jengibre
(Zingiber officinale) como desparasitante con respecto a la
mortalidad y reducción de movilidad en las larvas de Anisakis
simplex, una especie de nematodo gastrointestinal presente en mamíferos
marinos, peces, crustáceos y humanos.
La efectividad del extracto de jengibre (Zingiber officinale) al 3% para
eliminar e inmovilizar las larvas de Oesophagostomum dentatum, es
similar en una eficacia al 62% al de la IVM1% a las 48 h, comprobando en este
estudio que la efectividad biológica del extracto de jengibre (Zingiber
officinale) tiene un crecimiento con respecto a la curva de dosis
respuesta de este extracto. En Japón se han realizado investigaciones sobre la
actividad antihelmíntica de los compuestos aislados de la raíz del jengibre
(Zingiber officinale), syhogaol, shogaol, y gingerol. Han
comprobado que los compuestos anteriores matan y reducen la movilidad en larvas de
Anisakis simplex, una especie de nematodo gastrointestinal presente en mamíferos
marinos, peces, crustáceos y humanos entre las 24 y 72 h (Lin et al., 2010). A su vez, Acuña y Torres, (2010) en un estudio realizado de las propiedades
medicinales del jengibre (Zingiber officinale), han reportado al
Gingerol como el componente activo más estudiado por sus diversos efectos
farmacológicos, entre los más destacados antinflamatorios y antihelmíntico.
De acuerdo con estos resultados, comprobando la efectividad de jengibre (Zingiber
officinale), para eliminar e inmovilizar las larvas de
Oesophagostomum dentatum, se ha hecho una parametrización
adecuada al modelo matemático de Gompertz para estimar la dosis letal50
(DL50) del extracto de jengibre; como se muestra en el cuadro 2, tomando los siguientes valores para
la parametrización, de acuerdo con la aplicación Solver del programa Excel
de Microsoft Office 2017(Correa, 2004).
Parametrización del modelo de Gompertz para determinar DL50 de jengibre
% Inclusión
% EB
Gompertz
SC
JENGIBRE (Zingiber officinale)
0.1
2.07868
0.338436046
3.028449019
0.3
5.19798
3.382901301
3.294510684
0.5
11.4595
12.24378442
0.615102049
0.7
24.2727
25.12103484
0.719671995
0.9
36.0928
37.53441718
2.078260097
1
45.3562
42.67651026
7.180737091
2
60
61.13021894
1.277394859
3
62.9262
62.33817928
0.345768365
EB: % Efectividad Biológica. SC: Suma de Cuadrados
Los resultados ajustados al modelo paramétrico de Gompertz, han determinado que la
DL50 del jengibre (Zingiber officinale) se obtiene
con una inclusión del 1.1858% de este extracto; pudiendo así con este combatir un
50% de las larvas de Oesophagostomum dentatum presentes en la raza de CPM evaluados.
Diversos estudios realizados para estimar la DL50 han comprobado que el modelo
matemático de Gompertz es uno de los más precisos, sin presentar gran margen de
error, a comparación de otros modelos como lo son el polinómico, logístico y de
regresión lineal (Molina y Melo, 2010).
Con respecto a los demás extractos vegetales evaluados, los resultados arrojados por el software Statgraphics 9.0 no han sido relevantes, ya que su porcentaje de efectividad no supera el 18%.
CONCLUSIONES
La efectividad biológica del extracto de jengibre (Zingiber officinale) (3%),
es similar al de la ivermectina (1%). en un 62% de las muestras evaluadas; por lo
que se demuestra la efectividad del extracto para eliminar e inmovilizar las larvas
de Oesophagostomum dentatum, con una dosis letal50 es del 1.1858% estimada por el
modelo matemático de Gompertz. Los extractos vegetales evaluados de orégano
(Origanum vulgare), tomillo (Thymus) y
hierbabuena (Mentha spicata), si bien, tuvieron reportes de ser
evaluados anteriormente como antiparasitarios de nematodos gastrointestinales y
reportes de antibacterianos, no presentan un porcentaje de efectividad biológica
relevante (menor al 18%), contra las larvas de Oesophagostomum
dentatum.
Es necesario continuar con las evaluaciones para poder comprobar in vivo los
efectos del jengibre (Zingiber officinale), como antiparasitario en
las producciones de cerdos de traspatio contra las larvas de Oesophagostomum
dentatum, y así poder comparar su dosis y rentabilidad por kilogramo
del animal, con respecto a la ivermectina.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por el financiamiento otorgado para los estudios de maestría del segundo autor.
LITERATURA CITADAAbbott WS. 1987. A method of computing effectiveness of an insecticide. Journal of the American Mosquito Control Association. 3(2) 302-303. ISSN: 8756-971X https://www.biodiversitylibrary.org/content/part/JAMCA/JAMCA_V03_N2_P302-303.pdfAbbottWS.1987A method of computing effectiveness of an insecticideJournal of the American Mosquito Control Association323023038756-971Xhttps://www.biodiversitylibrary.org/content/part/JAMCA/JAMCA_V03_N2_P302-303.pdfAcuña O, Torres A. 2010. Aprovechamiento de las propiedades funcionales del jengibre (Zingiber officinale) en la elaboración de condimento en polvo, infusión filtrante y aromatizante para quema directa. 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dentatum in hairless Mexican pigs
Code:2020-38
ABSTRACT:
In Mexico, the Oesophagostomum dentatum is considered one of the main gastrointestinal endoparasites affecting the most important breed in rural pig farming, the hairless pig [Cerdo Pelon Mexicano (CPM)]. In this research, it was evaluated the in vitro biological efficacy of vegetable extracts of ginger, mint, thyme and oregano, with the aim of finding new natural alternatives for the control of Oesophagostomum dentatum; being compared its efficiency with ivermectin (IVM) and dimethylsulfoxide (DMSO). During the investigation, 380 samples of excrements (extracted directly from the anus) of CPM were collected, with an average weight (±SD) 40±5 kg per animal. These samples were analyzed by means of McMaster technique, achieving to identify Oesophagostomum dentatum eggs. The evaluation of the treatments' effectiveness was carried out in cell culture microplates incubated for 48 h at 25±1 ºC using different doses of the vegetable extracts and comparing their control effectiveness with IVM and DMSO. Obtaining that the biological effectiveness of the ginger extract (3%) is similar to that of the IVM (1%), achieving the elimination and immobilization of the Oesophagostomum dentatum larva in 62%. While the extracts of oregano, thyme and mint presented a percentage of biological effectiveness of less than 20%.
During the last years, in Mexico, pork production has generated more than 350,000 direct jobs and 1.7 million indirect jobs, causing an exponential growth of 10.79%, as a consequence of production increases and an improvement in prices in the market for consumption of this meat (Rebollar et al., 2016). One of the most important activities in the country is rural pig farming, being the Mexican Hairless pig (CPM) one of its main protagonists, since it has been characterized mainly by its rusticity and varied diet (Lemus and Ly, 2010). This type of production is affected by the presence of parasites that limit the productive potential of pigs, causing loss of appetite and immune response; consequently, a decrease in live weights and alterations in food conversion rates (Louie et al., 2007).
It is important to highlight that the prevalence of parasitosis depends exclusively on the
management system, the sanitation and hygiene conditions and on different types
of variables, such as climate, temperature and humidity, which influence the
life cycles of parasites (Frontera et al.,
2009); where one of the parasites with the highest prevalence in pig
production is Oesophagostomum dentatum (Cordero et al., 2000). Currently the control methods that
have been chosen for this type of parasitosis have been less and less effective,
because these nematodes have had a rapid evolution and development of resistance
against the chemicals used for their control, which represents a risk for human
health (Taylor et al., 2009a).
Currently, three large families of antiparasitics are frequently used by pig
farmers, macrocyclic lactones (IVM, moxidectin, doramectin), imidazoles,
tetrahydropyrimidine (levamisole, moratel) and benzimidazoles (fenbendazole,
oxfendazole and albendazole), depending on the areas in which production is
developed (Encalada et al., 2014). The
abuse of these chemicals has caused a problem of resistance to antiparasitics
(Kaplan and Vidyashankar, 2012).
Furthermore, their misuse can cause them to enter the environment as an equal
compound (unchanged) or as a metabolite; to later be transported and distributed
in water, sediments, soil and flora (Horvat et
al., 2012), causing considerable alterations in the ecosystem.
For this reason there is a growing interest in exploring natural alternatives, with properties capable of acting as bacteriostats, bactericides and antiparasitics (Aguilera, 2012). Plants, as part of their metabolism, synthesize different components called secondary metabolites (Dávila et al., 2017). Various investigations carried out have shown a great diversity of plants that possess these metabolites capable of inhibiting the growth and development of pathogens (Rizo et al., 2017).
The objective of this study was to evaluate the biological efficacy of different plant
extracts, such as: ginger (Zingiber officinale), oregano
(Origanum vulgare), thyme (Thymus) and
peppermint (Mentha spicata); previously reported for their active compounds
capable of acting as bactericides; comparing them with commercial products that
are currently used for the control of Oesophagostomum dentatum
present in CPM.
MATERIAL AND METHODS
Study area: The study was carried out at the Center for the Conservation of the
Mexican Hairless Pig and at the Laboratory of Parasitology and Biological
Control, of the Division of Life Sciences of the University of Guanajuato. The
samples were collected from CPM, with average weights 40 ± 5 kg, originating
from rural areas of the municipality of Huehuetla, Hidalgo and Zacapoaxtla,
Puebla, Mexico. A total of 380 samples taken from the rectum were collected and
placed in properly identified polyethylene bags (Aguilar et al, 2016). These were transferred to the laboratory,
where they were stored at a temperature of 4 ± 1ºC until their processing, which
was not greater than 48 h.
Vegetative material: Fresh leaves of mint (Mentha spicata),
thyme (Thymus) and oregano (Origanum vulgare)
(approximately 1kg per sample) were collected in the Zacapoaxtla municipality,
Puebla, located at an altitude of 1825 m. a.s. l., as well as ginger bulbs
(Zingiber officinale) (approximately 2 kg) in Huehuetla
municipality, Hidalgo, located at an altitude of 520 m. a. s. l. The material
was stored and transferred under refrigeration at 4 °C in a portable
mini-refrigerator (Chefman/RJ48-BLACK; Cooling & Heating Company, United
States), to avoid changes in its composition (Salem et al., 2006). Later they were subjected to a drying process
under the shade for a week, and finally both the leaves and bulbs were crushed
in a semi-industrial mill to a size of approximately 1 mm.
Obtaining the hydroalcoholic extract (HA): 100 g were used for each sample and
they were subjected to a maceration process with a mixture of water and methanol
(70:30 v/v) for 24 h, then the solution was filtered through different filters,
using (gauze and filter paper) to obtain an extract free of impurities. Once the
extract was obtained, it was frozen at -42 °C and finally the lyophilization
process was carried out (lyophilizer 7670520; LABCONCO, Kansas City, United
States). The lyophilized extract was frozen for later use (Salem et al., 2006).
Biological material: the parasitological diagnosis was made using the anaerobic
egg storage technique, described by (Coles et
al., 2006) modified; which consists of processing the samples using
the sedimentation technique found in the fecal content and allowing the parasite
eggs to concentrate at the bottom of the falcon tube. Thus, 30 mL of water and 4
g of feces were placed in each falcon tube, the sample was homogenized, pouring
it into a sieve and centrifuged for 5 min at 300 rpm. Subsequently, the
flotation technique was performed with 30 mL of glucose solution with a density
of 1: 200 (Cringoli et al., 2004);
achieving in this way that the parasite eggs at the bottom of the falcon tube
float due to the density of the solution; the mixture was again centrifuged for
5 min at 300 rpm. Finally, the sedimentation technique was performed again with
30 mL of distilled water to concentrate the eggs at the bottom of the tube,
centrifuging at 300 rpm and establishing the concentration of eggs per mL of
sterilized distilled water.
McMaster´s technique: The McMaster coproparasitoscopic technique was performed,
using a saturated Sheather solution with a specific gravity of 1,200 to estimate
the amount of eggs per g of excrement, the appropriate gravity being to carry
out the technique (Cringoli et al.,
2004). 2 g of excrement and 28 mL of saturated solution were used; the
sample was homogenized and placed in the McMaster chamber (MM-OP; PROLAB,
Jalisco, Mexico), using a pipette with gauze as a filter, avoiding obstruction
when reviewing the sample. The necessary volume was placed to perform the
reading on one side of the chamber, letting it rest for 2 min before being
observed under the microscope and carrying out the egg count (Rodríguez et al., 2016).
To estimate the number of eggs per g of excrement, the total volume obtained from mixing the excrement and the 30 mL solution was adjusted; considering that each compartment of the chamber measures 1 cm2 with a height of 0.15 cm, therefore the reading of both compartments is 0.30 mL of the total initial volume of 30 mL (Rodríguez et al., 2016). The concentration of eggs per g of feces of the parasite found was obtained by means of the McMaster formula (Bowman, 2013).
The parasite eggs were identified with the morphological keys (Coffin, 1952), and the larval diagnosis was made with the morphological keys of Van Wyk et al., (2004), being able to observe the cranial limb of the larvae, the terminal appendages and the morphology of the tail.
Experimental design: the experiment was established under a completely
randomized design of 19 treatments of 20 repetitions each, having a total of 380
experimental units. Each experimental unit consisted of 1200 µL (1100 µL of
ginger extract plus 100 µL of solution with 70 nematode larvae). Each
experimental unit consisted of a total of 100 µL of live nematodes (with an
average of 70 larvae).
Inhibition test of larval migration: a larval culture was carried out to bring
the nematodes to the third stage of the larva. For this, the necessary
conditions were provided for the hatching of the egg, making modifications to
the technique of McArthur et al., (2015).
Excrement was placed in perforated plastic containers, in order to provide an
aerobic environment, sterile sawdust was added and the excrement was homogenized
by adding sterile distilled water. The mixture was covered at 23-25 ºC for 10 d,
with a daily visual evaluation in case of requiring the addition of moisture and
oxygenating the samples, stirring the culture with the help of a spatula. Once
the incubation time had concluded, the culture was placed in a Baermann funnel;
in this way the larvae of Oesphagostomum dentatum were separated from the fecal
content. After one day in the funnel, the liquid was obtained and the larvae
were concentrated by centrifugation, to later carry out their counting and
dilutions, being identified with the morphological keys described by Quiroz (2011).
Dose and number of applications: Evaluations were made with doses of ginger
extract (Zingiber officinale) at 0.1%, 0.3%, 0.5%, 0.7%, 0.9%,
1%, 3% (Gawel et al., 2003); oregano
(Origanum vulgare) at 1%, 3% and 5%, as mentioned by
Borbolla and Velásquez, 2004 (citado en Guerra
et al., 2008); thyme (Thymus vulgaris) at 1%, 3% and
5% (Ramos and Hernández, 2018);
peppermint (Mentha spicata) at 1%, 3% and 5% (Lagarto et al, 1997); comparing the effect
of each one with the water control, DMSO 5% (Rendal et al., 2004) and IVM at 1% (Chávez et al., 2006).
For the dilution of the nematodes, a pipette graduated in 100 µL was used, with which the sample collected from the funnel was extracted, deposited in each well of the cell microplate of 1200 µL volume, a sample of 100 µL of nematodes; repeating the same procedure for each experimental unit. For the experimental units of the extracts of the organic treatments to be evaluated, a 5% extract stock solution was used (equivalent to 2 mL of extract + 38 mL of distilled water = 40 mL of solution); thus calculating the equivalents to each percentage as mentioned above for each experimental unit according to its inclusion percentage.
For the dilution of each treatment dose, the necessary amount of distilled water was deposited to complete the 1200 µL volume, in each experimental unit. The Control treatment was added with 100 µL of nematodes and a total of 1100 µL of distilled water. During the experiment, a single application of the antiparasitics was carried out, and with the help of a manual counter, the live and dead nematodes of each experimental unit were counted through a microscope with a 10x and 40x objective.
Statistical analysis: For the evaluation of each antiparasitic, its
effectiveness was determined, comparing it with the control group (Barrere et al., 2013). Mortality percentages
were adjusted with the Abbott formula
(Abbott,1987), and an analysis of variance of the different
treatments was performed and a comparison of means was made using a Tukey test
at 95% confidence, with the statistical package Statgraphics 9.0 (Cosialls et al., 2000).
RESULTS AND DISCUSSION
The percentage of biological effectiveness of the different antiparasitics evaluated was as
follows: first evaluation (0 h), it was 0% in each treatment; this for being the
first count after the application. For the second evaluation (24 h after the
application of the treatments), no significant differences were shown in the
mortality of nematodes between the evaluated treatments. In the third evaluation
(48 h after the application of the treatments), it was observed that the
percentage of biological effectiveness of the different treatments increased.
However, IVM (1%) and ginger extract (Zingiber officinale) (3%)
were the ones that showed the greatest effectiveness for the control of
Oesophagostomum dentatum (Table 1).
Percentage of biological effectiveness of the dewormers and plant extracts evaluated
Dewormers
% Inclusion
Evaluation 1 (0 hours)
Evaluation 2 (24 hours)
Evaluation 3 (48 hours)
%
T1: Control H2O
---
0
0
0
T2: Ivermectin
1
0
32.56
62.72
T3: DMSO
5
0
0
10.02
T4: Ginger
0.1
0
1.19
2.08
T5: Ginger
0.3
0
2.37
5.19
T6: Ginger
0.5
0
6.15
11.46
T7: Ginger
0.7
0
12.74
24.27
T8: Ginger
0.9
0
19.54
36.09
T9: Ginger
1
0
22.69
45.36
T10: Ginger
3
0
32.54
62.93
T11: Peppermint
1
0
1.67
3.04
T12: Peppermint
3
0
2.54
5.98
T13: Peppermint
5
0
4.66
9.53
T14: Thyme
1
0
1.49
2.49
T15: Thyme
3
0
2.71
5.80
T16: Thyme
5
0
3.85
8.03
T17: Oregano
1
0
3.29
6.48
T18: Oregano
3
0
5.48
11.18
T19: Oregano
5
0
8.80
17.02
Figure 1 shows that the biological
effectiveness of ginger extract (Zingiber officinale) (3%) is
similar to that of IVM (1%), in 62%; This extract has an exponential growth of
26.76% on average as its concentration percentage increases; while the extracts
of oregano (Origanum vulgare), thyme (Thymus)
and mint (Mentha spicata), maintain a percentage of biological
effectiveness of less than 20%; being these little effective in the mortality of
the evaluated nematode. As reported by a study by Taylor et al. (2009 a) a multiple resistance of
gastrointestinal nematodes to the main families of antiparasitics
(benimidazoles, imidazoles and microcyclic lactose) has been verified. Geurden
et al. (2015), reported that IVM has been one of the most used dewormers in the
last 40 years, due to the resistance that parasites develop in different sites
in Germany, France, England and Italy. 40 Animal Production Units (753 animals)
were studied, keeping a record of the eggs observed in the excrement and
observing a decrease in the effectiveness of IVM and moxidectin in the 8 Animal
Production Units.
Percentage of biological effectiveness of each dewormer used on the larvae of Oesophagostomum dentatum during the evaluation 1 (to 24 h after applying the treatment) and in the evaluation 2 (to 48 h after applying the treatment)
daa: days after application
In Mexico, Alonso et al., (2015) evaluated in 21 Animal Production Units in Veracruz state, during the period of January 2012-April 2013; among which only 2 Animal Production Units have parasites susceptible to IVM, being the other 15 those that present resistance; Furthermore, they were able to identify through questionnaires that this problem originates mainly because an inadequate deworming practice is carried out; being one of the main problems in the state of Guanajuato, since the producers indicate deworming without adequate control, which generated that only 2 Animal Production Units present parasitosis susceptible to IVM. Paraud et al., (2016) have verified in France, that the latter can not only modify the effectiveness of IVM, but also the existence of a cross resistance is possible, reporting a resistance to macrocyclic lactones in sheep, as they demonstrated the first multiple resistance of gastrointestinal nematodes against the same family of antiparasitic; This could be a problem in the present study, because 60% of the Animal Production Units evaluated presented resistance to IVM, and cross resistance in France was observed in farms suspected of resistance.
Paradoxically, research carried out in Mexico by Rizo
(2017), shows the great diversity of plants that present metabolites
capable of inhibiting the growth and development of pathogens
(Phytophthora ssp., Colletotrichum
gloeosporioides, Moniliophthora roreri); One of
these plants evaluated has been the extract of ginger (Zingiber
officinale). Studies reported by Lin et al. (2010), have verified the effect of ginger
(Zingiber officinale) as a dewormer with respect to
mortality and reduced mobility in the larvae of Anisakis simplex, a species of
gastrointestinal nematode present in marine mammals, fish, crustaceans and
humans.
The effectiveness of the extract of ginger (Zingiber officinale) at 3% to
eliminate and immobilize the larvae of Oesophagostomum dentatum, is similar in
an efficiency to 62% to that of IVM1% at 48 h, proving in this study that the
biological effectiveness of the Ginger extract (Zingiber
officinale) has a growth with respect to the dose response curve of
this extract. Research has been conducted in Japan on the anthelmintic activity
of compounds isolated from ginger root (Zingiber officinale),
syhogaol, shogaol, and gingerol. They have shown that the above compounds kill
and reduce mobility in Anisakis simplex larvae, a species of
gastrointestinal nematode present in marine mammals, fish, crustaceans and
humans between 24 and 72 h (Lin et al.,
2010). In turn, Acuña and Torres,
(2010) in a study conducted on the medicinal properties of ginger
(Zingiber officinale), have reported Gingerol as the most
studied active component for its various pharmacological effects, among the most
prominent anti-inflammatory and anthelmintic.
According to these results, verifying the effectiveness of ginger (Zingiber
officinale), to eliminate and immobilize the larvae of
Oesophagostomum dentatum, an adequate parameterization has
been made to the Gompertz mathematical model to estimate the lethal dose50
(LD50) of the ginger extract; as shown in table
2, taking the following values for the parameterization, according to
the Solver application of the Microsoft Office 2017 Excel program (Correa, 2004).
Parametrization of the Gompertz model to determine DL<sub>50</sub> of ginger
% Inclusion
% BE
Gompertz
SS
GINGER (Zingiber officinale)
0.1
2.07868
0.338436046
3.028449019
0.3
5.19798
3.382901301
3.294510684
0.5
11.4595
12.24378442
0.615102049
0.7
24.2727
25.12103484
0.719671995
0.9
36.0928
37.53441718
2.078260097
1
45.3562
42.67651026
7.180737091
2
60
61.13021894
1.277394859
3
62.9262
62.33817928
0.345768365
BE: % Biological effectiveness. SS: Sum of squares
The results adjusted to the Gompertz parametric model have determined that the
LD50 of ginger (Zingiber officinale) is obtained
with an inclusion of 1.1858% of this extract; thus being able to combat 50% of
the larvae of Oesophagostomum dentatum present in the race of
CPM evaluated. Various studies carried out to estimate the LD50 have verified
that the Gompertz mathematical model is one of the most accurate, without
presenting a large margin of error, compared to other models such as polynomial,
logistic and linear regression (Molina and Melo,
2010).
With respect to the other vegetable extracts evaluated, the results obtained by the Statgraphics 9.0 software have not been relevant, since its percentage of effectiveness does not exceed 18%.
CONCLUSIONS
The biological effectiveness of ginger extract (Zingiber officinale) (3%) is
similar to that of ivermectin (1%) in 62% of the samples evaluated. Therefore,
the effectiveness of the extract to eliminate and immobilize the larvae of
Oesophagostomum dentatum is demonstrated, with a lethal
dose50 is 1.1858% estimated by the mathematical model of Gompertz. Although the
vegetable extracts of oregano (Origanum vulgare), thyme
(Thymus) and peppermint (Mentha spicata)
were evaluated, although they had reports of being previously evaluated as
antiparasitic of gastrointestinal nematodes and reports of antibacterials, they
do not present a relevant percentage of biological effectiveness ( less than
18%), against Oesophagostomum dentatum larvae.
It is necessary to continue with the evaluations to be able to verify in
vivo the effects of ginger (Zingiber officinale),
as an antiparasitic in the productions of backyard pigs against the larvae of
Oesophagostomum dentatum, and thus be able to compare its
dose and profitability per kilogram of the animal, with regarding
ivermectin.
ACKNOWLEDGEMENT
We are grateful to the National Council of Science and Technology (CONACyT), for the funding granted for the master's studies of the second author.